Hi.In questo video imparerai come eseguire studi di risonanza magnetica iperpolarizzata del cuore di topo perfuso. David Shaul, uno studente MD / PhD in laboratorio, ti guiderà attraverso le varie tecniche e procedure. Oggi apprendiamo un protocollo per lo studio del metabolismo iperpolarizzato del carbonio-13 piruvato, combinato con la spettroscopia NMR 31P.
Il metabolismo del piruvato si trova al crocevia del metabolismo aerobico e anaerobico. E come tale, è di grande valore per studiare varie condizioni del cuore. Quindi, iniziamo.
Il cuore del topo è isolato e perfuso con tampone Krebs-Hensleit, all'interno di un tubo NMR da 10 millimetri. Il cuore viene quindi inserito nello spettrometro NMR. Lì, viene registrato uno spettro 31P per osservare l'energetica cardiaca e il pH, osservando le risonanze di adenosina trifosfato, fosfocreatina e fosfato inorganico.
Nel frattempo, un campione di piruvato etichettato con carbonio-13 in prima posizione è iperpolarizzato. E dopo che si verifica la dissoluzione, viene iniettato al cuore per consentire la misurazione di lattato, inorganici e piruvato le attività organizzate in tempo reale. Un giorno prima dell'esperimento, preparare 400 millilitri di tampone Krebs-Henseleit modificato.
Come primo passo, risolviamo questi ingredienti in acqua bidistillata. Quindi, bolle questa soluzione con questa miscela di ossigeno per 20 minuti, quindi aggiungere cloruro di calcio. Regolare il pH a 7,4.
Il giorno dell'esperimento, aggiungere glucosio e insulina. Impostare il bagno d'acqua a 40 gradi Celsius. Inserire la bottiglia media con 200 millilitri di tampone KH nel bagno.
Utilizzare la pompa peristaltica per riciclare il tampone KH. Collegarsi ad esso, una linea di afflusso e due linee di deflusso. Inserire le linee di afflusso e deflusso nel buffer KH riscaldato.
Utilizzare un miscelatore di ossigeno con 95% di O2 e 5% di CO2. Quindi, inserire la linea dell'ossigeno nel tampone KH riscaldato. Accendere la pompa peristaltica e regolarla su un peso del flusso costante di 7,5 millilitri al minuto.
Vogliamo calibrare il sistema prima di introdurre il cuore. Pertanto, inserire le linee di afflusso e deflusso in un tubo NMR da 10 millimetri e inserire una sonda di temperatura ottica compatibile con NMR. Inserire il tubo NMR nel foro del magnete.
Regolare il serbatoio di riscaldamento a 42 gradi Celsius e utilizzare il riscaldamento NMR per regolare la temperatura all'interno del magnete a 37 gradi Celsius. Si noti che la temperatura NMR viene effettivamente monitorata nel buffer KH che si trova all'interno del magnete, utilizzando un nucleo di temperatura compatibile NMR. Ora possiamo usare la spettroscopia 31P per osservare il segnale del fosfato inorganico all'interno del tampone.
Questa è l'attrezzatura necessaria per la procedura chirurgica. Mettere 100 millilitri di tampone KH nel ghiaccio e bollire con la stessa miscela di ossigeno. Anestetizzare il mouse all'interno della camera della scatola con isoflurano al 3,3% miscelato con aria ambiente per induzione, ad una portata di 340 millilitri al minuto.
Trasferire il topo in anestesia nasale. Ridurre al 2,9% isoflurano alla stessa portata. Pizzica il piede per verificare un riflesso negativo del dolore al pedale e che il mouse sia completamente anestetizzato.
Iniettare nel mouse 300 unità di eparina di sodio, per via intraperitoneale. Tagliare la pelle due centimetri sotto il processo xifoideo. Tagliare la parete addominale per esporre la cavità addominale.
Posizionare il morsetto a forbice tra il processo xifoideo e la pelle del torace e usarlo per ritrarre la parete toracica ed esporre il diaframma. Forare il lobo destro del diaframma e quindi tagliare il resto del diaframma. Tagliare attraverso la linea mediana della parete toracica evitando il contatto con organi più profondi come il cuore e i vasi.
Iniettare 200 unità di eparina di sodio al ventricolo sinistro del cuore. Iniettare il cuore con 0,1 millilitri di 0,5 molari di KCL per ottenere l'arresto cardiaco. Ritrarre il tessuto del timo anteriormente e tagliarlo dalla radice per esporre l'aorta sottostante.
Cerca di rimuovere quanto più tessuto timo possibile evitando danni all'aorta. Rimuovere il tessuto toracico residuo per consentire il passaggio libero per il catetere endovenoso. Posizionare la pinza curva sotto l'aorta e usarla per posizionare il nodo di sutura di seta attorno all'aorta.
Posizionare una pinza curva alla radice aortica e ritrarre il cuore in modo inferiore per esporre e allungare l'aorta. Iniettare tre millilitri di tampone KH ghiacciato al ventricolo sinistro per rimuovere i coaguli di sangue dall'aorta e per preservare la vitalità del cuore. Metti diverse gocce anche sulla superficie del cuore.
Utilizzare l'ago del catetere endovenoso per perforare la parete arteriosa dell'aorta senza danneggiare la parete posteriore. Quindi, inserire il catetere con l'ago, circa tre millimetri. Successivamente, rimuovere l'ago e contemporaneamente inserire il tubo del catetere per ulteriori cinque millimetri, ma evitare di entrare nella camera del ventricolo sinistro.
Posizionare l'adesivo cianoacrilato nella regione di puntura dell'aorta, per evitare che il tubo del catetere scivoli fuori dall'aorta mentre stringe la sutura. Legare delicatamente un nodo tra l'aorta e il tubo di incannulazione. Iniettare altri cinque millilitri di tampone KH al ventricolo sinistro e verificare che fluisca attraverso il tubo di incannulazione.
Questo segna che l'incannulamento ha avuto successo. Rimuovere la pinza curva dalla radice aortica. Scollegare il cuore dai visceri circostanti evitando il contatto con l'agente di incannulazione e con il tessuto cardiaco.
Collegare immediatamente la cannula a una siringa tampone KH ghiacciata. È importante evitare l'introduzione di bolle d'aria nel cuore. Rimuovere il tessuto non cardiaco.
In questa fase, dovresti osservare il battito cardiaco riprendere. Tagliare i bordi di sutura di seta rimanenti. Nella sala NMR, scollegare la cannula dalla siringa e collegarla al tampone KH a 37 gradi del sistema di perfusione.
Quindi, inserire il cuore nel tubo NMR da 10 millimetri. Posizionare il cuore al centro della sonda e quindi inserire il tubo NMR con il cuore al foro dello spettrometro NMR. Eseguire lo shim" utilizzando il segnale dell'acqua sul canale 1H fino a raggiungere la larghezza della linea da 10 a 20 hertz.
Quindi, acquisire spettri 31P del cuore utilizzando l'angolo di inversione di 50 gradi e TR di 1,1 secondi allo stato stazionario. Queste condizioni favoriscono il segnale di ATP, rispetto ai segnali di PCr e fosfato inorganico. Osservare i segnali di ATP e PCr, significa che il tessuto è vitale all'interno dello spettrometro NMR.
Utilizzare un programma di elaborazione dedicato per analizzare gli spettri. Eseguire uperizzazione esponenziale di sette hertz. Utilizzare la correzione della linea di base, quindi assegnare il segnale della fosfocreatina a meno 2,5 ppm.
Osservare i segnali di fosfato inorganico, fosfocreatina e ATP. Polarizzare il campione di piruvato, che è etichettato in prima posizione con carbonio 13, per 80 minuti. Dopo 80 minuti di polarizzazione, il campione è pronto per la soluzione.
Ecco come avviene lo scioglimento. Iniettare il contenuto di dissoluzione nel cuore utilizzando l'approccio di perfusione continua. Questo approccio è stato progettato per fornire il piruvato senza alcuna interruzione del livello di perfusione e ossigenazione dei tessuti.
Il mezzo di soluzione che contiene il piruvato iperpolarizzato viene iniettato in un tubo conico, quindi iniettato manualmente in un bypass, quindi dirigiamo la perfusione attraverso il bypass e il contenuto del bypass scorre continuamente attraverso il cuore e alla fine si lava. Utilizziamo una velocità di perfusione di 7,5 millilitri al minuto e un volume di bypass di 22 millilitri. Quindi, che il mezzo iperpolarizzato scorre attraverso il cuore per circa tre minuti.
In questa finestra temporale, utilizziamo la spettroscopia al carbonio 13 per misurare i segnali di piruvato, lattato e bicarbonato. Utilizziamo uno schema di eccitazione che alterna l'eccitazione del lattato e l'eccitazione del bicarbonato, con intervalli di sei secondi. Abbiamo usato l'eccitazione selettiva saturante per acquisire il segnale di carbonio 13.
In questo approccio, il substrato piruvato è minimamente eccitato, mentre i metaboliti, lattato e bicarbonato, sono completamente eccitati. Osservare e registrare il metabolismo del piruvato di carbonio 13 per circa tre minuti. L'indagine metabolica è terminata dopo che il segnale del piruvato decade.
Questa figura mostra gli spettri 31P registrati da un cuore di topo perfuso con tampone KH. Lo spettro acquisito dal cuore, mostra i segnali di alfa, beta e gamma ATP, PCr e Pi.Il segnale Pi è composto da due componenti principali, Il componente a sinistra, che appare in un campo più alto, rappresenta il segnale Pi che è principalmente dovuto al tampone KH a un pH di 7,4. Il bordo e la componente meno omogenea a destra, che si trova in un campo inferiore, mostra il segnale Pi che si trova in un ambiente più acido.
Questo componente deriva dal tessuto cardiaco. Successivamente, il segnale Pi del tessuto è stato ottenuto sottraendo il segnale Pi buffer dall'intero segnale Pi. È stato quindi convertito da una scala ppm a una scala di pH.
Il pH viene studiato utilizzando un'analisi multiparametrica del segnale Pi tissutale calcolando la media ponderata, la mediana ponderata, il massimo globale e l'asimmetria. Questa figura mostra il tipico spettro NMR al carbonio 13, ottenuto utilizzando l'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto iperpolarizzato, durante l'iniezione iperpolarizzata di piruvato di carbonio 13 al cuore di topo perfuso. Notare i segnali di lattato piruvato e bicarbonato.
Il segnale del piruvato viene troncato qui per scopi visualizzati. I cambiamenti nelle intensità del segnale del substrato e dei metaboliti sono dovuti al rilassamento T1, alla frequenza di eccitazione e alle caratteristiche del flusso. Successivamente, vengono tracciate le intensità integrate di questi segnali.
Inoltre, abbiamo tracciato in cerchi neri, l'intensità integrata del piruvato che è stata raccolta per il decadimento T1 e per l'effetto delle eccitazioni di frequenza 4D, utilizzando una costante di tempo di decadimento effettiva di 32 secondi. Questa correzione è risultata produrre la dinamica del flusso prevista per il substrato. Wash-in, plateau e wash-out.
Utilizzando questo corso temporale del segnale corretto, abbiamo selezionato per ulteriori analisi, la finestra temporale che è evidenziata in azzurro, in cui la concentrazione di piruvato nel tubo NMR, era costante e massima. I tassi di LDH e PDH sono stati calcolati per ciascuno dei punti temporali selezionati e quindi calcolati in media. I valori principali per questa iniezione sono forniti in unità di nanomole al secondo.
In sintesi, abbiamo mostrato il sistema sperimentale per eseguire studi metabolici iperpolarizzati sul piruvato nel cuore di topo perfuso. Speriamo che questa informazione sia stata utile.
