Il nostro protocollo apre nuove possibilità per indagare su come avviene la replicazione sul DNA danneggiato. Le tecniche possono rilevare la formazione e la riparazione di lacune di DNA a singolo filamento, opposte alla lesione del DNA. La nucleasi S1 fende il DNA a singolo filamento e consente il rilevamento di lacune post-replicative.
Questo approccio è stato utilizzato per la prima volta dal Dr.Meneghini e dal Dr.Cordiero-Stone nel 1970 in Brasile, e recentemente adattato da noi al test della fibra di DNA. L'utilizzo della tecnica qui descritta per studiare la formazione e la riparazione delle lacune post-replicative può fornire informazioni sul meccanismo di riparazione del DNA e sulla risposta allo stress di replicazione che mantengono l'integrità del genoma. Per entrambi i protocolli qui descritti, la fibra S1 e i saggi di gap-filling, è fondamentale includere tutti i controlli per garantire un'interpretazione accurata dei dati.
La procedura sarà dimostrata da Davi J.Martins, uno studente di dottorato del nostro laboratorio, e dalla dott.ssa Annabel Quinet, una collaboratrice che in precedenza ha sviluppato queste tecniche quando lavorava nel nostro gruppo. Per cominciare, aspirare i terreni di coltura e aggiungere immediatamente i terreni di coltura con 20 micromolari di media IDU alle cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per esattamente 20 minuti.
Quindi, lavare rapidamente le cellule con PBS preriscaldato due volte e irradiarle con 20 joule per metro quadrato UV-C. Utilizzare cellule non trattate come controlli. Aggiungere immediatamente il mezzo con CldU 200 micromolari alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per esattamente 60 minuti.
Successivamente, lavare le cellule con PBS preriscaldato due volte e permeabilizzarle con il tampone CSK 100 per due o 10 minuti in base alla linea cellulare a temperatura ambiente. Dopo la permeabilizzazione CSK, i nuclei con quasi nessun citoplasma possono essere visti rispetto a quelli prima della permeabilizzazione. Versare con attenzione PBS lungo il lato di ciascun pozzetto per lavare i nuclei con PBS.
Quindi, lavare i nuclei con tampone S1. Incubare i nuclei nel tampone S1 con 20 unità per millilitro S1 nucleasi, e senza la nucleasi S1, per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare il buffer S1 e aggiungere lo 0,1% di BSA in PBS.
Raschiare i nuclei e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri approssimativamente annotato. Tenere i tubi sul ghiaccio tutto il tempo. Centrifugare i nuclei a circa 4.600 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Sospendere i pellet in PBS ad una concentrazione di circa 1.500 cellule per microlitro. Posizionare i tubi sul ghiaccio e procedere immediatamente alla preparazione della fibra di DNA diffondendo il protocollo. Annotare i vetrini del microscopio con una matita di carbonio e posizionarli su un vassoio.
Toccare la parte inferiore del tubo per garantire l'omogeneizzazione e aggiungere due microlitri di celle nella parte superiore della diapositiva corrispondente. Aggiungere sei microlitri del tampone di lisi e lisare le cellule tubando su e giù circa cinque volte. Utilizzare la punta della pipetta per tirare leggermente la goccia verso il fondo del vetrino e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per lisare i nuclei.
Inclinare la diapositiva a circa 20-40 gradi e consentire alla goccia di diffondersi sul fondo della diapositiva a una velocità bassa costante. Lasciare asciugare la diapositiva a temperatura ambiente al buio per 10-15 minuti. Quindi, immergerli in un barattolo contenente la soluzione fissante appena preparata e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per fissare il DNA sui vetrini.
Lavare i vetrini con PBS due volte per cinque minuti e denaturare il DNA con acido cloridrico 2,5 molari appena preparato per 40-60 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini con PBS tre volte per cinque minuti e bloccare con il 5% di BSA precedentemente riscaldato per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius. Toccare delicatamente la carta per rimuovere il liquido in eccesso dalle diapositive.
Aggiungere 30 microlitri di anticorpi primari alle diapositive a goccia e posizionare un coperchio sulla parte superiore. Incubare da 1 a 1,5 ore a temperatura ambiente in una camera buia e umida. Mettere le diapositive in un barattolo con PBS per uno o due minuti e quindi rimuovere con cura i foglietti di copertura.
Lavare con PBST in un barattolo tre volte per cinque minuti e posizionare i vetrini in PBS. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando delicatamente su una carta e aggiungere 30 microlitri degli anticorpi secondari ai vetrini a goccia. Posizionare un coperchio sulla parte superiore.
Incubare per 45-60 minuti a temperatura ambiente in una camera buia e umida. Ripetere i passaggi per lavare le diapositive e rimuovere nuovamente il PBS in eccesso e aggiungere 20 microlitri del reagente di montaggio a goccia alle diapositive. Posizionare una copertura sulla parte superiore ed evitare bolle.
Posizionare una goccia di olio per immersione vicino alla parte superiore del vetrino in cui sono state lisate le cellule. Usa il canale verde e cerca i punti verdi sullo sfondo per trovare lo stato attivo. Aprire il software Leica Application Suite, fare clic su Acquisisci e selezionare il canale verde.
Regolate le impostazioni del canale verde prima dell'analisi. Quindi, passa al canale rosso e regola le impostazioni. Trova la principale concentrazione di fibre e spostati verso i bordi per trovare le singole fibre ben diffuse, non sovrapposte.
Utilizzare un solo canale per selezionare le regioni per le immagini ed evitare potenziali distorsioni. Fare clic sull'icona Acquisisci sovrapposizione e regolare il software per il corretto ingrandimento del microscopio. Scatta da 15 a 20 immagini per diapositiva insieme all'intera diapositiva sul canale verde e poi sul canale rosso.
I due canali vengono ora uniti e l'overlay creato viene spostato in una cartella univoca. È possibile vedere le fibre con i colori rosso e verde. Aprire il software ImageJ, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla quinta icona, selezionare la seconda opzione, quindi selezionare lo strumento Linea segmentata.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per disegnare il percorso esatto del tratto rosso o verde e fare clic con il pulsante destro del mouse per interrompere il disegno. Premere il pulsante M sulla tastiera per misurare la lunghezza. Per la fibra S1, tenere traccia delle misurazioni dei tratti rossi e verdi per ciascuna fibra e misurare le lunghezze del tratto rosso e verde da almeno 150 fibre da immagini diverse.
Una fibra S1 è mostrata in queste immagini rappresentative. Il tratto di DNA nascente di controllo senza le lacune e impermeabile alla scissione da parte della nucleasi S1 è mostrato qui. Il tratto del DNA positivo per gli spazi vuoti scissi dalla nucleasi S1 ha comportato una lunghezza del tratto CldU più corta.
Uno schema di etichettatura differenziale ampiamente descritto nel manoscritto di testo può essere eseguito per etichettare gli eventi di riempimento delle lacune. In questo test, denominato gap-filling assay, le tracce IDU più lunghe con almeno un cerotto CldU o meno patch CldU corrispondono a una bassa densità di riempimento del gap. I tratti IDU più corti, con almeno un cerotto CldU, e i tratti IDU più lunghi con più patch CldU, corrispondono ad un'elevata densità di riempimento dei gap.
La fase di permeabilizzazione di questo protocollo è cruciale affinché la nucleasi S1 agisca sulle lacune formate durante la replicazione del DNA danneggiato. La nucleasi S1 può anche essere utilizzata nel protocollo di analisi della cometa per rilevare le lacune formate durante la replicazione del DNA danneggiato che persiste dopo il trattamento. Il test delle fibre S1 ha aperto la strada al nuovo paradigma secondo cui le lacune post-replicative possono causare vulnerabilità al cancro, in particolare nei tumori al seno e alle ovaie portatori di mutazioni nei geni BRCA1 e 2.
