Questo approccio guidato dal lignaggio consente l'analisi proteomica di importanti eventi di sviluppo con risoluzione spaziale e temporale all'interno dell'embrione vertebrato impartendo informazioni che non sarebbero accessibili attraverso misurazioni dell'intero embrione. Questo approccio può essere facilmente esteso allo studio di proteine, metaboliti e trascritti da diverse cellule embrionali mentre si differenziano durante lo sviluppo. Questo metodo può far progredire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari che controllano lo sviluppo normale e della malattia, compresi i meccanismi di induzione dei tessuti e l'impegno del destino cellulare durante lo sviluppo iniziale.
Utilizzare un cappio per guidare ogni embrione in un pozzetto e posizionarli delicatamente in modo che la cellula di interesse mirata sia ad angolo retto rispetto al microago. Seguire le mappe del destino dei tessuti di xenopus laevis per identificare la cellula precursore del lignaggio di interesse. Utilizzare due pinze per affilare per rimuovere delicatamente la membrana vitellina che circonda l'embrione.
Isolare le singole cellule dall'embrione mediante dissezione manuale usando una pinza. Iniziare impostando l'ago per iniezione contenente la soluzione tracciante della linea. Montare l'ago per microiniezione in un portapipette controllato da un micromanipolatore multiasse.
Collegare il supporto per micropipette a un microiniettore e riempire l'ago con il tracciante di lignaggio applicando una pressione negativa. Calibrare l'ago e regolare le dimensioni della punta dell'ago e il tempo di iniezione per erogare circa un nanolitro della soluzione tracciante della linea misurata in olio minerale. Assicurarsi che la dimensione della goccia iniettata sia accurata e regolare le impostazioni dell'iniettore, se necessario.
Inondare il piatto di argilla per microiniezione con una soluzione al 3% fCAL e trasferire circa 10 embrioni nel piatto di argilla utilizzando una pipetta di trasferimento. Iniettare le cellule di interesse con circa un nanolitro di destrano fluorescente o 200 picogrammi di mRNA GFP. Utilizzando un microscopio stereo, confermare il successo dell'etichettatura cellulare.
Assicurarsi che venga iniettata solo la cellula desiderata. Scartare gli embrioni contenenti cellule danneggiate o etichettate in modo errato seguendo le politiche istituzionali. Trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri contenente 0,5 volte la soluzione di Steinberg.
Coltivali tra 14 e 25 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Trasferire da tre a cinque embrioni in un piatto di agar contenente 0,2 volte la soluzione di Steinberg per micro dissezioni. Utilizzare una pinza per sezionare il clone etichettato dall'embrione.
Raccogliere il tessuto sezionato con una pipetta da 0,5 a 10 microlitri e depositarli in una microcentrifuga. Utilizzando una pipetta, aspirare il mezzo che circonda il tessuto raccolto per limitare i sali nel campione per evitare interferenze con l'analisi HRMS. Congelare immediatamente le cellule isolate ponendo il flaconcino del campione su ghiaccio secco o azoto liquido.
Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi della spettrometria di massa. Per l'elaborazione di campioni a singola cellula mediante CE, denaturare le proteine riscaldando il campione a 60 gradi Celsius per circa 15 minuti. Quindi equilibrare il campione a temperatura ambiente per cinque minuti e aggiungere tripsina ai campioni per la digestione.
Per l'analisi mediante NanoLC, lisare fino a cinque tessuti sezionati in 50 microlitri di tampone di lisi. Facilitare il processo pipettando il campione su e giù. Per elaborare i tessuti sezionati, incubare il lisato a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi pellettare i detriti cellulari e le piastrine di tuorlo a quattro gradi Celsius mediante centrificazione a 4.500 RCF. Trasferire il surnatante in un flaconcino di microcentrifuga pulito e aggiungere il 10% di SDS per ottenere una concentrazione finale dell'1% di SDS nel lisato. Per i tessuti, aggiungere 0,5 molari ditiotreitolo al lisato per ottenere una concentrazione finale di circa 25 millimolari.
Quindi incubare il lisato per 30 minuti a 60 gradi Celsius per ridurre chimicamente i legami disolfuro nelle proteine. Aggiungere iodoacetammide 0,5 molari per ottenere la concentrazione finale di circa 75 millimolari nel lisato e incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere 0,5 molari ditiotreitolo come il volume iniziale per estinguere i reagenti rimanenti dalla reazione di alchilazione.
Precipitare le proteine in acetone durante la notte come descritto nel protocollo testuale e ricostituirle in bicarbonato di ammonio 0,5 molari. Aggiungere tripsina per la digestione del campione e incubare le fiale a 37 gradi Celsius. Per separare i peptidi utilizzando CE, ricostituire la proteina digerita in uno o due microlitri del solvente campione.
Vortice il campione misto e centrifusione a 10.000 RCF per due minuti a quattro gradi Celsius per pellet detriti cellulari. Inizializzare lo strumento CE-ESI lavando il capillare CE con il BGE. Inserire un microlitro di campione nel flaconcino del campione e iniettare da uno a 10 nanolitri del campione nel capillare di separazione CE mediante iniezione idrodinamica.
Trasferire l'estremità di ingresso del capillare di separazione CE nel BGE. Avviare la separazione elettroforetica aumentando gradualmente la tensione di separazione CE dalla terra a terra. Potenziali da 20 a 28 kilovolt con una corrente inferiore a 10 microampere garantiscono prestazioni strumentali stabili e riproducibili per l'analisi.
Per separare utilizzando Nano LC, risospendere il campione peptidico nella fase mobile A.La concentrazione e il volume di iniezione del campione dipendono dal sistema LC e dalla colonna disponibili. Trasferire il campione in un flaconcino LC. Caricare circa 200 nanogrammi a due microgrammi di campione peptidico nella colonna analitica C18 e separare i peptidi a una velocità di flusso di 300 nanolitri al minuto utilizzando l'eluizione del gradiente come descritto nel manoscritto di testo.
Utilizzando una telecamera, controllare il flusso di liquido attraverso l'emettitore di elettrospray e ispezionare visivamente la configurazione per eventuali perdite. Acquisire eventi di spettrometria di massa e sequenziare i peptidi come descritto nel manoscritto testuale. Sono state rilevate differenze di traslazione genica tra cellule D11 sezionate da diversi embrioni utilizzando CE-ESI-HRMS.
I cloni cellulari sezionati marcati con lignaggio sono stati analizzati da LC-HRMS. L'analisi del percorso delle proteine ha mostrato una traduzione proteica e un metabolismo energetico sovraregolati nell'organizzatore di Spemann con il neuroectoderma. Il neuroectoderma prodeo è stato arricchito in proteine associate al trasporto nucleare del carico proteico nella cellula, probabilmente indicando eventi a valle dopo la segnalazione.
L'analisi di arricchimento delle funzioni molecolari ha indicato una sovraregolazione nell'inizio della traduzione, nel legame dell'RNA e nel legame del complesso del proteasoma, suggerendo un ruolo per il turnover proteico dinamico nello sviluppo dell'organizzatore di Spemann. Selezionare solo embrioni stereotipati per questo protocollo per migliorare la riproducibilità e l'interpretazione dei risultati. Il tessuto sezionato deve essere trasferito in un flaconcino e immediatamente congelato contenente il minor tampone possibile per ridurre al minimo la contaminazione da sali tampone.
Questo approccio ci ha permesso di studiare la dinamica delle proteine nelle cellule identificate e nelle linee cellulari negli embrioni vivi. Le nuove informazioni che abbiamo ottenuto sulla produzione spazio-temporale di importanti proteine nei tessuti in via di sviluppo ci hanno permesso di progettare esperimenti mirati per valutare la loro funzione biologica.
