The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

1. Preparazione della Cultura media e Piatti <ol><li> Rendere 200 ml di Biggers Whitten Whitten e (BWW) 17 soluzione di lavoro aggiungendo 5,54 g di NaCl, KCl 0,356 g, 0,25 g CaCl 2, 0,162 g H 2 KO 4 P, e 0,294 g MgSO 4 a 1 L di acqua Milli-Q . Questa è la soluzione madre e può essere conservato a 4 ° C per un mese. </li><li> Dalla soluzione di riserva, aggiungere 420 mg di NaHCO 3 -, 200 mg di glucosio, piruvato 6 mg di sodio, 600 mg albumina sierica bovina, 0,74 ml di lattato di sodio, e 4,0 ml di tampone HEPES a 193 ml di BWW magazzino. Questa è la soluzione di lavoro ed è sempre fatta fresca nel giorno e equilibrati a 37 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Per rendere la cannula, prendere polietilene (PE) tubi con un diametro interno di 0,4 mm e un diametro esterno di 1,1 mm e tenere a fuoco basso (tipicamente fiamma metanolo) tale che il tubo inizia a fondere. Tirare subito il tubo OUTWard per allungare e rendere il diametro esterno stretto. </li><li> Tagliare a produrre un restringimento di una estremità, che consente una più facile incannulamento dei vasi deferenti. </li><li> Tagliare l&#39;altra estremità della cannula per circa 15 cm. Inserire un ago da 30 G nel estremità smussata, e allegare una siringa da 3 ml di esso (completamente ritratto). </li><li> Fare un boccaglio di aspirazione tagliando una lunghezza 20 centimetri di tubo in PE (4,2 mm di diametro interno, 6.4 mm di diametro esterno). Inserire un boccaglio in una fine. </li><li> Inserire il supporto tubo di vetro micro-capillare e il vetro micro-capillare stesso (tipicamente 3 ml di un mouse, 40 microlitri di un topo). </li></ol> 2. Rimozione di epididimi da mouse <ol><li> Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione. </li><li> Prendere l&#39;animale e fare una piccola incisione nello scroto per esporre epididimo. Estrarre testicolo e epididimo fuori della cavità con un paio di orologiai # 5 pinze. </li><li> Tagliare il dotto deferente tale che almeno 1-2 cm rimangono attaccate alla epididimo cauda. Inoltre, tagliare i dotti efferenti prossimali e tessuto connettivo dell&#39;epididimo al testicolo e rimuovere l&#39;intera traccia riproduttivo maschile. </li><li> Inserire l&#39;intera traccia riproduttivo maschile sotto un microscopio da dissezione con un intervallo di ingrandimento nell&#39;ordine di 5-40X. </li></ol> 3. Cannulating il Epididimo <ol><li> Nastro lungo la cannula al microscopio, tale che 1-2 cm del ristretta (a forma di cono) estremità è libera e visibile attraverso la lente. </li><li> Prendete un paio di orologiai # 5 pinze e stringere con delicatezza ogni lato dei vasi deferenti e tirare il dotto deferente sulla cannula, in modo tale che la cannula va in vasi deferenti. </li><li> Prendete una lunghezza di non riassorbibile seta trattata nera intrecciata (dimensioni 5-0) e fare un nodo attorno ai vasi deferenti cannulate. Assicurarsi che il nodo viene tirato strettamente per tenere la cannula all&#39;interno dei vasi deferenti quando la pressione dell&#39;aria from la siringa viene applicato. </li></ol> 4. retrograda o backflush di Caudal Epididymal spermatozoi <ol><li> Utilizzando orologiai # 5 pinze, afferrare l&#39;estremità distale dei epididimi cauda e rimuovere la tunica albuginea, al fine di esporre un singolo tubulo dell&#39;epididimo. </li><li> Utilizzando le pinze, tirare delicatamente il tubulo fuori per esporre e poi prendere in giro a parte in modo da creare un&#39;apertura per lo sperma per essere rilasciato. </li><li> Spingere delicatamente sui 3 ml (mouse) o 20 ml (ratto) siringa in modo da espellere l&#39;aria dalla siringa in vasi deferenti. Alla pressione appropriata, spermatozoi inizierà a venire lentamente del tubulo rotto all&#39;estremità distale del epididimo cauda. In questo momento, applicare il vuoto al boccaglio per disegnare spermatozoi nel capillare di vetro. Nota: Tipicamente in un topo, 2-3 ml di spermatozoi può essere ottenuto a seconda dell&#39;età dell&#39;animale. Una volontà di ratto, a resa media 30-40 ml. </li></ol> 5. Lavaggioe lisi gli spermatozoi in preparazione Proteomica <ol><li> Espellere gli spermatozoi dal capillare di vetro in 1 ml di soluzione di BWW (37 ° C) soffiando delicatamente nel boccaglio o attaccare una siringa e di espellere l&#39;aria in modo da spingere il spermatozoi indietro del capillare. </li><li> Una volta che le cellule spermatiche sono diffusi, lavare 3x (300 xg, 5 min) con 1 ml BWW per rimuovere le proteine ​​contaminanti. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante. Nota: A questo punto, le cellule spermatiche possono essere congelati per un uso successivo. </li><li> Solubilizzazione proteine ​​usando 4% CHAPS, 2 M tiourea, e 50 Tris mM, pH 7.4 per 1 ora con vortex intermittente. </li><li> Dopo la lisi delle cellule, centrifuga (10.000 xg, 20 min), prendere surnatante e trasferire ad un nuovo tubo. Nota: A questo punto, la quantificazione delle proteine ​​può essere eseguita. </li></ol> 6. legame disolfuro Riduzione e Alchilazione <ol><li> Aggiungi DTT 10 mM come una concentrazione finale di proteine ​​lisati, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Aggiungere 50 mM idodoacetamide come concentrazione finale di lisato, vortex e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li></ol> 7. Precipitazione <ol><li> Metanolo cloroformio precipitare il campione aggiungendo 1 volume di lisato (400 microlitri come esempio), aggiungere un volume (400 ml) di metanolo e 0,5 volumi (200 microlitri) cloroformio. </li><li> Vortex il campione e di spin (10.000 xg, 2 min). </li><li> Si noti che due fasi appariranno dopo centrifugazione. Eliminare tutti ma 2 mm di strato superiore (facendo attenzione a non disturbare l&#39;interfaccia). </li><li> Aggiungere 1 volume (400 ml) di metanolo, tubo invertito 1-2x delicatamente per mescolare e centrifugare di nuovo (10.000 xg, 15 min). Gettare il surnatante sprecare e pellet asciugare all&#39;aria per 3-4 min. </li></ol> 8. tripsina Digestione <ol><li> Ricostituire tripsina in 25 mM di bicarbonato di ammonio contenente 1 M urea ad un rapporto di 50: 1 (W / W; proteine: tripsina) e incubate overnight a 37 ° C, preferibilmente a 700 rpm su un thermomixer. </li><li> Spin (10.000 xg, 15 min) a pellet materiale digerito. Trasferire il surnatante in nuova provetta. </li></ol> 9. fosfopeptide Enrichment <ol><li> Eseguire purificazione e arricchimento fosfopeptidi dal triptico digest come descritto in precedenza 18. Diluire peptidi triptici 10 volte in tampone DHB [DHB tampone costituito da: 350 mg / ml di acido 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitrile), 2% (v / v) TFA (trifluoroacetico L&#39;acido)] e si applicano a secco TiO2 perline (200 mcg). </li><li> Lasciare in un rotatore a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare il campione con il tampone DHB, ruotare e rimuovere il surnatante. Quindi lavare il campione tre volte con tampone di lavaggio [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] per rimuovere il DHB. </li><li> Dopo la centrifuga finale, eluire direttamente le fosfopeptidi utilizzando tampone di eluizione aggiungendo 25 ml di idrossido di ammonio 2,5%, pH ≥ soluzione 10.5. Spin e rimuovere il surnatante. Neutralizzare immediatamente con ~ 0,3 ml di acido formico. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

I passaggi critici per il successo e riproducibile analisi proteomica di spermatozoi sono: 1) la purezza del materiale di partenza; 2) la rimozione dei sali e detergenti indesiderati; 3) denaturazione proteine ​​per la loro estensione in modo da consentire tripsina per digerire un alto rendimento di proteine ​​e 4) minimizzando campione movimentazione per ridurre la perdita di peptide. Per backflush successo l&#39;epididimo cauda, ​​è essenziale per individuare la zona da cui spermatozoi uscirà. In caso di ratto e topo, questo è all&#39;apice della zona concava, nel mezzo della regione caudale dell&#39;epididimo (vedi figura 2A). Se uno viene ulteriormente verso i vasi deferenti, risciacquo è più facile e il tasso di successo è generalmente superiore. Tuttavia, questo ha la perdita di numero di spermatozoi. In alternativa, se si tenta di muoversi più prossimale al corpus, allora la quantità di pressione necessaria per spingere il spermatozoi indietro attraverso il epididymcondotti Al è spesso così alta, che danno ai epididimo avviene inevitabilmente. Backflush dell&#39;epididimo avviene tradizionalmente con acqua satura di olio minerale e una soluzione salina bilanciata nella siringa stessa come un mezzo per rimuovere gli spermatozoi 22-25. Entrambe le procedure sono potenzialmente problematici di LC-MS. In primo luogo, minerale rischia di bloccare le nano-C18 nano-colonne che sono essenzialmente utilizzati in tutto il mondo per l&#39;analisi e la cura proteomica devono essere prese in modo che nessuno sia portato avanti nella procedura. In questo caso, non è possibile proseguire e il campione viene sostanzialmente perso. Questo può essere superato con l&#39;uso di BWW o altre soluzioni saline bilanciate nella siringa, tuttavia, anche se questo è successo, presto riconosciuto che molti degli spermatozoi mobili diventano non appena la soluzione BWW entra in contatto e mescolato con il epididimale caudale cellule. Per aggirare questo problema semplicemente backflush gli spermatozoi con l&#39;aria. Non solo è la quallità di spermatozoi paragonabile a quella dei metodi a base liquida, ma la quantità è identico. Fosfoproteomica è forse uno dei pochi modi per stabilire quali vie di segnalazione si verificano in spermatozoi post-eiaculazione. Una delle principali vie che stiamo indagando è il processo di capacitazione. Gli spermatozoi deve sottoporsi &quot;capacitazione&quot; prima che sia in grado di legarsi ad un uovo. In pratica, questo è realizzato sostanzialmente incubando spermatozoi per un periodo di tempo (topo 40 min; ratto 1,5 ore; umana 3-24 ore) in soluzione BWW con albumina sierica. In precedenza, noi ed altri hanno dimostrato un ruolo per diverse chinasi coinvolte in capacitazione. Di interesse, la cancellazione della PKA μ II produrre topi i cui spermatozoi nuotare spontaneamente in vitro, ma non può subire iperattivazione 26. Quest&#39;ultima è una caratteristica di capacitazione, per cui gli spermatozoi cambiare il loro modello di nuoto da una velocità elevata, bassa ampiezza, a un minimovelocità, ampiezza alta battuto frequenza. Abbiamo dimostrato chinasi a valle coinvolti in questo processo sono PP60-CSRC (SRC) 13,27 c-yes 28 e c-ABL 14. È interessante notare che l&#39;inibizione di SRC ferma capacitazione-dipendente fosforilazione della tirosina 13. Tuttavia, questo può essere superato con l&#39;acido okadaico, suggerendo che SRC non è direttamente coinvolto nella insorgenza generale di fosforilazione della tirosina 29, ma possono disciplinare una fosfatasi 29. Il problema con l&#39;utilizzo BWW come mezzo per forzare spermatozoi fuori dell&#39;epididimo è che, una volta attivato, mouse spermatozoi richiedono soltanto circa 40 min a capacitate. Dato che l&#39;isolamento di spermatozoi può prendere 5 min / mouse e spesso diversi topi sono utilizzati in un esperimento, allora spermatozoi sarà a diversi stadi di maturazione all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Per ovviare a questo, la pressione dell&#39;aria può essere utilizzato per spingere il spermatozoi dall&#39;epididimo caudali in una cannula di vetro. Non solo tutte le inact spermaive ed essenzialmente come sarebbero trovate nell&#39;ambiente caudale, rende possibile il confronto fosfoproteomica non mobili e mobile. La gestione per fosfoproteomica campione deve essere ridotto al minimo quando si confrontano spermatozoi in due diversi stati funzionali. L&#39;uso di metanolo cloroformio rispetto ad altri metodi tradizionali di proteine ​​precipitazione 1) riduce la necessità di ulteriori fasi di lavaggio, 2) rimuove quasi tutte le tracce di sali e grassi e 3) ha una comprovata capacità di precipitare proteine ​​poco abbondanti su TCA 19. Protein precipitazioni prima tripsina digestione è consigliato dal momento che non solo fa questo aiuto per denaturare proteine ​​(che aiuta la digestione tripsina), ma rimuove molti dei metaboliti MS-compatibili presenti nella cellula. Il confronto di fosfopeptidi sperma può essere fatto in diversi modi. Al livello di base, un semplice confronto della fosfopeptide identificato in un campione, a quella in un&#39;altracampione nel processo noto come &quot;conteggio spettrale&quot; può essere fatto. Tuttavia la critica è stata in questo approccio fondamentalmente perché i primi studi di proteomica usavano basse repliche (per una discussione più vedere Lundren et al. 30). Un approccio più sofisticato è quello di esaminare l&#39;intensità della massa genitore peptide e confrontarlo con gli altri campioni (di confronto libero-label). Nell&#39;esempio illustrato nella figura 4, un peptide assente dal da non mobili (figura 4 in alto), ma presenti nella mobili (Figura 4 in basso) spermatozoi da m / z 650-670 può essere visto. Questo processo, denominato etichetta MS quantificazione libera è una strategia senza etichetta. Una strategia alternativa comunemente usato per ridurre la quantità di piste richiesti per la quantificazione proteomica è utilizzare isotopi. Poiché la massa di un isotopo è diverso, lo spettrometro di massa può essere utilizzata per confrontare le intensità del Eluting peptidi. Tuttavia, a differenza di molti altri tipi di cellule, alcune etichettatura isotopica non può essere applicato a spermatozoi. Ad esempio, l&#39;aggiunta di isotopi stabili (un isotopo pesante viene aggiunto un campione, mentre una versione più leggera viene aggiunto ad un altro) può essere utilizzato in coltura tissutale. Quando gli isotopi vengono incorporati nella proteina, un&#39;analisi proteomica può essere eseguita combinando i due campioni (multiplazione). Tuttavia, nel caso di spermatozoi, ciò non può essere fatto, semplicemente in virtù del fatto che 1) marcatura isotopica richiede diversi passaggi (fino a 8) in coltura tissutale e 2) gli spermatozoi senza trascrizione genica nucleare e traduzione e quindi, essi non possono incorporare comunque isotopi in tutte le loro proteine. Un modo per aggirare questo è quello di ordinare i topi radiomarcati, tuttavia, questi sono notoriamente costosi. Un approccio alternativo è di utilizzare un tag chimica. Questo è stato fatto quando i topi non capacitati sono stati confrontati con i topi capacitati. In questo caso, un D 0 e D <sub&gt; 3 -label stato utilizzato per distinguere tra un campione e l&#39;altro nello spettrometro di massa 31. Altri approcci possono includere l&#39;uso di iTRAQ (tag isobarica per la quantificazione relativa e assoluta), per cui lisine sono etichettati chimicamente con diversi isotopi di massa; iCAT (isotopo codificato tag affinità) per cui cisteine ​​sono etichettati con diversi isotopi di massa e l&#39;etichettatura di acqua pesante e leggero. In ogni caso, comunque, una cosa deve essere tenuto a mente. La MS riporta solo ciò che è presente in un campione, e questo è un riflesso di tutto ciò che è accaduto a quel campione fino a quel momento. Minimizzare la manipolazione del campione, mentre massimizzando il rendimento ad ogni passo è necessario per un successo analisi proteomica.

Uscito dal testicolo, spermatozoi sono molto differenziati ancora notevolmente, queste cellule sono immature 1,2. Come tali, non hanno completa funzionalità, tra cui la possibilità di nuotare e si legano ad un ovocita 3. Anche se è necessaria ulteriore maturazione della cellula sperma, questo non può avvenire tramite percorsi canonici, poiché in questa fase del loro processo di differenziazione cellulare, sono incapaci di trascrizione genica e in seguito biosintesi delle proteine ​​4. È conferita la competenza biologica su spermatozoi che lasciano testicolo ed entrano una parte del sistema riproduttivo maschile noto come epididimo 5. L&#39;epididimo è una stretta spirale, tubo altamente differenziato che collega i condotti efferenti (del testicolo) per le deferenti ed è presente in tutti i mammiferi maschi 6. Gli spermatozoi progressivamente acquisire il loro potenziale di concimazione durante la discesa epididimale, basandosi sull&#39;ambiente luminale continua evoluzione che è created da parte delle cellule epiteliali dell&#39;epididimo locali 7. Le varie attività secretoria e ri-assorbenti presenti nell&#39;atto epididymal milieu di modificare lo sperma in sé, cambiando il suo proteine, carboidrati e lipidi composizione 6. L&#39;importanza dell&#39;epididimo, in particolare la regione iniziale &#39;caput&#39; di questa struttura è stata esemplificata utilizzando tecniche chirurgiche legatura 8. Gli spermatozoi conservati all&#39;interno del testicolo da efferente condotto legatura sono completamente privo di qualsiasi capacità di fecondare l&#39;ovocita 9-11. Oltre all&#39;ambiente epididimale, trasduzione del segnale all&#39;interno dell&#39;opera spermatozoi al post-traslazione modificare il complemento spermatozoo esistente. Ad esempio, gli spermatozoi dai primi regioni dell&#39;epididimo visualizzare diversi modelli di fosforilazione di proteine ​​rispetto a queste ultime regioni 5,12. Questo non è sorprendente dal momento che ci sono grandi differenze nel capability dello sperma da queste regioni. Ad esempio, gli spermatozoi dei primi anni, caput epididimo sono immotilite. Al contrario, le cellule spermatiche della regione cauda subiranno avanti motilità progressiva volta posto in mezzo isotonico. Dato che le cellule spermatiche epididymal sono incapaci di de-novo biosintesi delle proteine, tutti i percorsi intrinseci che regolano la funzionalità degli spermatozoi deve avvenire attraverso modificazioni post-traduzionali (PTM). Quindi, è ovvio che la proteomica, e in particolare la ricerca di PTM, come la fosforilazione deve essere uno degli elementi principali, se vogliamo capire sperma maturazione delle cellule. Un metodo alternativo per ottenere spermatozoi dalle epididymidies usare retro-backflush 13-16. Sebbene questa tecnica è certamente più tempo e richiede un maggior grado di abilità da parte dell&#39;operatore, gli spermatozoi ottenuta costantemente dimostrare purezza superiore al 99,99%. Inoltre, a differenza di tutte le altre tecniche, spermatozoi can essere isolato in uno stato quiescente, rendendo possibile studiare come viene iniziata la motilità degli spermatozoi. Come preparazione del campione è l&#39;aspetto più importante per l&#39;analisi proteomica, l&#39;isolamento degli spermatozoi è diventato uno degli aspetti più importanti di studi sperma-proteomica. Questo protocollo fornisce una spiegazione su come spermatozoi sono isolati dal epididimo cauda. In seguito a questo, la procedura di arricchimento 2 fosfopeptide TiO è delineato, con specifico riferimento su come estrarre peptidi dalle spermatozoi altamente differenziate. L&#39;approccio MS può essere utilizzato per distinguere mutevoli fosfopeptidi se si dovesse confrontare la epididymal spermatozoi caudale in uno stato (immotile o non capacitati) ad un altro (mobili, capacitati, acrosoma reagito, etc.) rendendo questo un approccio potente per studiare sperma funzione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

Gli spermatozoi sono abbastanza unico tra i tipi di cellule. Sebbene prodotta nel testicolo, sia la trascrizione del gene nucleare e la traduzione sono spenti una volta la cella rotonda pre-cursore comincia ad allungarsi e differenziarsi in ciò che è morfologicamente riconosciuto come uno spermatozoo. Tuttavia, lo spermatozoo è molto immaturo, non avendo capacità di motilità o riconoscimento uovo. Entrambi questi eventi si verificano una volta il transito spermatozoi un organo secondario noto come epididimo. Durante il passaggio ~ 12 giorni che ci vuole per una cella di sperma di passare attraverso l&#39;epididimo, modificazioni post-traduzionali delle proteine ​​esistenti svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione della cellula. Un aspetto importante di questa è fosforilazione proteica. Al fine di caratterizzare gli eventi di fosforilazione che si svolgeranno durante la maturazione degli spermatozoi, devono essere stabiliti due popolazioni di cellule di sperma puri e pre-frazionamento di fosfopeptidi. Utilizzando tecniche di lavaggio indietro, un metodo per l&#39;isolamento di puro spermatozoi of alta qualità e la resa dei epididimi distali o caudale è delineato. Sono spiegati i passaggi per solubilizzazione, la digestione, e pre-frazionamento di fosfopeptidi spermatozoi attraverso TiO2 cromatografia di affinità. Una volta isolato, fosfopeptidi possono essere iniettati in MS per identificare entrambi gli eventi di fosforilazione di proteine ​​su specifici aminoacidi e quantificare i livelli di fosforilazione che si svolgono durante i processi di maturazione degli spermatozoi.

La qualità dei risultati di un&#39;analisi proteomica è fortemente dipendente dal materiale di partenza. Con MS moderni, lievi contaminazioni in preparazione del campione sono facilmente raccolti. Pertanto, è fondamentale, in caso di proteomica spermatozoo, scegliere un metodo che dà spermatozoi altamente puro. Come illustrato nella figura 1, risciacquo retrograda viene utilizzato per recuperare spermatozoi dall&#39;epididimo cauda. Ciò comporta cannulating deferenti con tubi in PE che permette di applicare lentamente la pressione dell&#39;aria dalla siringa attaccata. Figura 1A mostra l&#39;epididimo cauda insieme ai vasi deferenti. Figura 1B è un primo piano colpo di come i vasi deferenti è legata in cui il È inserito cannula. In tal modo, gli spermatozoi vengono rilasciati al termine di una tubulo asportato dagli epididimi caudale. Come mostrato in Figura 2A, gli spermatozoi vengono estratti dalle regioni apice della caudun epididimo e vengono aspirati in un capillare di vetro in uno stato quiescente (Figura 2B). Questo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali &quot;swim-up&quot;, non ultimo dei quali è la possibilità di eseguire un&#39;analisi phoshoproteomic di spermatozoi prima e dopo l&#39;attivazione di motilità. Gli spermatozoi può essere espulso in mezzi di propria scelta. Figura 2C (lato sinistro), dimostra come lo sperma guardare subito dopo l&#39;espulsione in BWW media. Molte delle cellule sono raggruppate insieme. Tuttavia, dopo 10 min di competenza delle cellule è dimostrato perché nuotare verso l&#39;omogeneità nella soluzione (Figura 2C, giuste cellule lato). Dal momento che la tecnica di risciacquo ha un impatto minimo sulle cellule spermatiche, otteniamo quasi il 100% la motilità e le cellule disperdono rapidamente nella media senza provocazione esterna. In un tipico esperimento risciacquo, lo sperma recuperato dalla Swiss-Mouse contienetra 1-5 x 10 6 cellule. Questo è fortemente dipendente dall&#39;età dell&#39;animale e può variare da diversi ceppi di topi. In un ratto norvegese, si ottiene tipicamente 200 x 10 6 spermatozoi, ± 20%. Figura 2D rappresenta la purezza degli spermatozoi ottenuti dal epididimo ratto cauda. Oltre al campione stesso, uno dei principali problemi riguardanti la preparazione del campione è la resa di tripsina digestione. Protein precipitazione gioca un ruolo importante, non solo nel rimuovere detergenti e sali indesiderati, entrambi i quali sono incompatibili con MS, ma anche proteine ​​denaturazione. Abbiamo trovato la precipitazione metanolo-cloroformio per funzionare al meglio. Non solo è stato segnalato questa procedura per precipitare bassa abbondanti proteine ​​meglio di altri compreso TCA precipitazioni 19, ma ha ulteriori vantaggi. Dopo precipitazione TCA, è spesso necessario regolare il pH dopo sospensione del pellet TCA che possa rimanere abbastanzaacida. Sebbene il pellet precipitato di TCA può essere lavato in soluzioni organiche alti per rimuovere l&#39;acido, questo aggiunge al campione manipolazione e irriproducibilità di risultati. La mancata neutralizzare l&#39;acido comporterà poveri rendimenti peptide triptici. Metanolo-cloroformio precipitazione non è solo veloce ma non acidificare il campione. La Figura 3 illustra il pellet di proteine ​​tipicamente visto da 100 mg di campione tra l&#39;interfase inferiore e superiore. L&#39;isolamento di fosfopeptidi può avvenire in diversi modi; tuttavia riproducibilità dipende da come il campione è stato gestito fino al questa fase. Uno dei metodi di sviluppo più comuni è TiO2, originariamente sviluppato dal gruppo di Martin Larsen 18,20,21. Sebbene descritto come un processo per utilizzare in microcolonne, possiamo ottenere dati riproducibili mediante cromatografia batch. Il successo del processo è fortemente dipendente dal tampone di eluizione, che deve essere pazza<html> e con la corretta composizione; altrimenti fosfopeptidi non vengono eluiti affatto. La riproducibilità dei dati di protocollo e rappresentativi da TiO 2 arricchito fosfopeptidi da cauda epididimale sperma in un non mobili (figura 4 in alto) e mobili (Figura 4 in basso) stato da m / z 650-670 può essere visto. Abbiamo dimostrato che questa è una tecnica estremamente riproducibile anche utilizzando repliche biologica 17. Le strisce blu che appaiono nel tempo sono peptidi eluizione da un nano-colonna C18 come aumenta la concentrazione di acetonitrile. Chiaramente, nella popolazione mobili (n = 3 mostrato, n = 8 tipicamente funzionare), vi è un gruppo peptide, con una massa monoisotopico intorno al 651,5 Da gamma che è completamente assente nell&#39;intervallo non mobili. Spettrometria di massa tandem viene quindi utilizzato per identificare questo peptide. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Incannulazione del epididymis cauda (A) Immagine del epididimo cauda. La cannula si è registrato fino a esporre di circa 1-2 cm dalla fine pre-tirato. Questo è inserito nei vasi deferenti utilizzando sottili # 5watchmakers pinze. (B) La cannula viene tenuto in posizione legando seta fine attorno a un segmento che contiene sia i vasi deferenti e la cannula. Dal murino, approssimativamente 2-3 microlitri di cellule dell&#39;epididimo caudale e fluido sono raccolti ad una concentrazione di 1 x 10 6 / ml. Dal ratto (in figura), a circa 30-40 ml di liquido si ottengono a concentrazioni simili. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figura 2: capillare di vetro utilizzato per raccogliere competente spermatozoi dell&#39;epididimo. (A) Un tubulo dall&#39;apice della cauda e<html> pididymis è isolata e rotto. La posizione approssimata da cui ciò avviene è mostrato. (B) La parte superiore dell&#39;immagine mostra un tubo capillare di vetro vuoto e il fondo mostra uno da un ratto precedenza backflush. Non vi è alcuna contaminazione del sangue e la contaminazione delle cellule epiteliali minima. (C) Poiché gli spermatozoi sono ancora diluito nel fluido dell&#39;epididimo, non hanno iniziato ad attivare. Quando il spermatozoi vengono inizialmente espulsa in una soluzione BWW, escono come &quot;stringa&quot; compact (lato sinistro della mano). La competenza della cella è facilmente stabilito, dal momento che dopo 10 minuti la maggior parte degli spermatozoi nuotare in soluzione senza alcun disturbo esterno (lato destro della mano). (D) Una foto di una aliquota di cellule dell&#39;epididimo caudali subito dopo che sono stati lasciati a nuotare out dimostra la purezza delle cellule. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3:. Metanolo-cloroformio precipitazione volta spermatozoi stato solubilizzato, la frazione solubile è metanolo-cloroformio precipitato per garantire denaturazione delle proteine ​​e la rimozione di sostanze contaminanti. Il pellet di proteine ​​appare sull&#39;interfaccia tra le fasi di metanolo / acqua e cloroformio. Lo strato superiore viene rimosso attentamente in modo da non disturbare il pellet. È comune lasciare circa 2-3 mm della fase superiore in modo da nessuna proteina è persa. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4:. Tipica TiO2 profilo fosfopeptide -enriched Utilizzando il protocollo descritto, caudale epididymal spermatozoi sono stati isolati in uno immotile (in alto, N = 3) o stati di mobili (in basso, N = 3). Un cluster peptide con una massa mono-isotopica di ~ 651,5 Dun è dimostrato di essere presente nelle popolazioni motilità ma completamente assente in quelli immotile (freccia). Confronti di questo tipo sono indicati come &quot;privo di etichetta (MS-based)&quot;. La massa peptide e tempo di ritenzione vengono poi utilizzati per indirizzare il composto per spettrometria di massa tandem e identificare la proteina da cui il peptide è stato derivato.

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Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Analisi fosfopeptide di roditori Epididymal spermatozoi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Video: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

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Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Principi di Chirurgia roditori per il chirurgo nuovo

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...