Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

Riepilogo

Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.

Abstract

La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.

Introduzione

Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo¹. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 1987⁷ e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulteriori ricerche hanno indicato che si trattava di un sistema immunitario adattativo procariotico che dipende dalla nucleasi guidata dall'RNA Cas9 per combattere i fagi⁸. Il sistema CRISPR/Cas9 modificato artificialmente consiste principalmente di due componenti, un singolo RNA guida (sgRNA) e la proteina Cas9. Lo sgRNA è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) complementare alla sequenza bersaglio e da un crRNA transattivante ausiliario (tracrRNA), che è relativamente conservato. Quando il sistema CRISPR/Cas9 viene attivato, l'sgRNA forma una ribonucleoproteina (RNP) con la proteina Cas9 e guida Cas9 al suo sito bersaglio attraverso l'accoppiamento di basi delle interazioni RNA-DNA. Quindi, il DNA a doppio filamento può essere scisso dalla proteina Cas9 e, di conseguenza, la rottura del doppio filamento (DSB) emerge vicino al motivo adiacente del protospaziatore (PAM) del sito bersaglio 9,10,11,12. Per mitigare il danno causato dalle DSB, le cellule attiverebbero risposte complete al danno del DNA per rilevare in modo efficiente i danni genomici e avviare la procedura di riparazione. Ci sono due distinti meccanismi di riparazione nella cellula: non-homologous end joining (NHEJ) e homology-directed repair (HDR). NHEJ è la via di riparazione più comune che può riparare rapidamente le rotture del doppio filamento del DNA e prevenire l'apoptosi cellulare. Tuttavia, è soggetto a errori a causa del fatto che lascia piccoli frammenti di inserzioni e delezioni (indel) vicino ai DSB, che di solito si traduce in uno spostamento del frame di lettura aperto e quindi può portare al knock-out genico. Al contrario, la riparazione omologa è un evento piuttosto raro. A condizione che ci sia un modello di riparazione con sequenze omologhe al contesto del DSB, le cellule occasionalmente riparano la rottura genomica secondo il modello vicino. Il risultato dell'HDR è che il DSB viene riparato con precisione. In particolare, se c'è una sequenza aggiuntiva tra le sequenze omologhe nel modello, verrebbero integrate nel genoma tramite HDR, e in questo modo, le inserzioni geniche specifiche potrebbero essere realizzate¹³.

Con l'ottimizzazione e lo sviluppo delle strutture sgRNA e delle varianti proteiche Cas9, il sistema di editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è stato applicato con successo anche nella ricerca di insetti, inclusi ma non limitati a Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. Per quanto a conoscenza degli autori, sebbene RNP costituiti dalla proteina Cas9 e sgRNA trascritti in vitro siano stati utilizzati per l'editing del genoma delle locuste^20,21,22, manca ancora un protocollo sistematico e dettagliato per la costruzione mediata dalla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti omozigoti della locusta migratoria.

La locusta migratrice è un importante parassita agricolo che ha una distribuzione globale e pone minacce sostanziali alla produzione alimentare, essendo particolarmente dannoso per le piante graminose, come grano, mais, riso e miglio²³. L'analisi della funzione genica basata su tecnologie di modifica del genoma può fornire nuovi obiettivi e nuove strategie per il controllo delle locuste migratorie. Questo studio propone un metodo dettagliato per eliminare i geni delle locuste migratorie attraverso il sistema CRISPR / Cas9, compresa la selezione dei siti bersaglio e la progettazione di sgRNA, la sintesi in vitro e la verifica degli sgRNA, la microiniezione e la coltura di uova, la stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale, l'individuazione dei mutanti e il passaggio e la conservazione dei mutanti. Questo protocollo potrebbe essere usato come riferimento basale per la manipolazione della stragrande maggioranza dei geni delle locuste e può fornire preziosi riferimenti per l'editing del genoma di altri insetti.