Il nostro protocollo consente lo studio della parodontite periapica in un modello di mouse accessibile e controllato. Pertanto, questo protocollo presenta vantaggi rispetto ai campioni dei pazienti o ai modelli in vitro. I principali vantaggi di questa tecnica sono che il topo è stato ben studiato e che il metodo è tecnicamente semplice in termini di requisiti di struttura ed è conveniente.
Poiché questa procedura è impegnativa a causa delle piccole dimensioni dei denti, è utile visualizzare la procedura per conoscere il posizionamento e le prestazioni della tecnica. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del dito, posizionare il mouse sul lato della mano dominante su una superficie in schiuma di polistirolo estrusa a celle chiuse e fissare le zampe con del nastro adesivo. Utilizzando un singolo elastico per paio di incisivi e aghi lunghi appuntati sulla superficie in schiuma di polistirolo estruso a celle chiuse, aprire la bocca.
Utilizzare le forcep chiuse attaccate alla schiuma per ritrarre la guancia destra. E posizionare la schiuma e il mouse al microscopio e una sorgente luminosa. Quindi, ritrarre la lingua usando una spatola dentale e utilizzare un ago calibro 27 per iniettare da 25 a 50 microlitri di anestetico locale nella piega mucobuccale adiacente al primo molare mandibolare.
Si deve osservare gonfiore tissutale intorno al sito di iniezione. Per esporre la polpa, utilizzare qualsiasi motore dentale adatto dotato di un rullante dentale rotondo ad alta velocità di 0,8 millimetri a una velocità di 800 colpi al minuto, per forare la parte occlusale del primo molare mandibolare destro fino a quando le corna di polpa non sono visibili attraverso la dentina. Utilizzare un file K o H, numero otto o numero 10 per perforare la polpa e rompere la dentina che copre le corna di polpa mesiale e distale per consentire l'inserimento del file nelle corna.
Continuare a lavorare con i file all'interno della polpa il più profondamente possibile mentre si allargano le aperture con i file, il sanguinamento dalla polpa si osserva in genere intorno ai bordi affilati del dente con il bur e rimuovere il dente dall'aclusione per ridurre il dolore durante l'esperimento. Utilizzare un micro pennello per pulire eventuali detriti. E lasciare il contralaterale lasciato prima molare mandibolare come controllo.
Per i primi tre giorni dopo la procedura, pesare gli animali e iniettare 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina intraperitonealmente una volta al giorno. Continuare a monitorare gli animali nei prossimi 42 giorni pesando e valutando comportamentale generale da due a tre volte a settimana. E consegnare pellet alimentari ammorbiditi con acqua in una piastra di Petri sul pavimento della gabbia durante tutto il periodo di follow-up.
Alla fine dell'esperimento, utilizzare forbici chirurgiche e forcep per raccogliere la parte della mascella che include i tre molari sui lati trattati e non trattati. E usa le forcelle per staccare il più possibile il tessuto molle, lasciando per lo più ossa e denti sui campioni. Risciacquare brevemente il tessuto in PBS.
Prima della fissazione in paraformaldeide al quattro per cento per 24-48 ore. Quindi risciacquare i campioni tre volte in PBS fresco. Per la tomografia micro-calcolata, o analisi Micro-CT posizionare i tessuti raccolti in un tubo di 12 millimetri di diametro contenente 1,5 millilitri di PBS sullo stadio dello scanner.
Con i campioni orientati in modo che le superfici buccali o linguali del dente e della radice giacevano parallele al fondo del tubo. Utilizzare una spugna per separare i campioni. E coprire la parte superiore del tubo con pellicola flessibile.
Selezionare il file di controllo e impostare l'energia su 70 kilovolt, l'intensità su 114 microampere e la risoluzione su una dimensione Voxel a sei micrometri a cubetti. Fate clic su Scout-View. Quando viene visualizzata l'immagine, fare clic su Linea di riferimento e contrassegnare l'area degli esempi per la scansione, facendo clic su Aggiungi analisi dopo ogni campione.
Dopo aver contrassegnato tutti gli esempi, passare all'elenco attività e selezionare Avvia attività di interazione. Per il contouring delle fette Micro-CT, selezionare la fetta che rappresenta il centro approssimativo del dente, in cui sono presenti la polpa coronale, la polpa radicolare di entrambi i canali ed entrambi i forameni apicali. Fate clic sul pannello contorno e, partendo dal punto distale dell'apice della radice distale, segnate il bordo apicale coronally fino all'area apicale del paque radiale, attraverso il bordo mesiale dell'apice della radice mesiale, seguendo il bordo distale della radice mesiale, e il bordo mesiale della radice distale, attraverso la regione di furcazione.
Copiate e incollate il contorno risultante e regolate il contorno in base a cinque fette posizionate su entrambi i lati della fetta centrale. Per calcolare il volume tissutale del contorno contrassegnato per ogni campione, in Valutazione micro-TC selezionare Attività e fare clic su Valutazione 3D. Quindi, nella finestra Valutazione 3D, fare clic su Seleziona e selezionare un filtro per calcolare il volume del tessuto.
Al termine dell'analisi Micro-CT, trasferire i tessuti dallo scanner a un tubo di micro centrifuga contenente un millilitro di EDTA per 10 giorni. Al termine della decalcificazione, mettere i campioni in cassette istologiche contenenti concentrazioni crescenti di etanolo, per un'ora per concentrazione. Dopo la seconda immersione in etanolo, trasferire i campioni in xilene per due immersioni di un'ora, Prima di trasferire le cassette in paraffina liquida di 60 gradi Celsius in una cappa chimica durante la notte per consentire allo xilene di evaporare.
La mattina seguente, posizionare i campioni disidratati con la corona e le radici orientate parallelamente al fondo dello stampo, in una macchina di blocco istologica per incorporare i campioni in paraffina. Per ottenere sezioni, fissare il campione di blocco di paraffina sul blocco di taglio dei microtoni e tagliare il campione fino a raggiungere il tessuto di interesse. Quando una qualsiasi parte del dente è visibile, iniziare ad ottenere sezioni spesse sei micrometri, regolando l'angolo di taglio fino a ottenere sezioni sagittali che includono la polpa coronale e radicolare e il foro apicale.
Qui viene mostrata un'intera mattiere trattata. L'ingrandimento del primo molare destro trattato, consente l'osservazione dell'esposizione sia delle corna di polpa mesiale e distale che dell'ingresso ai canali. L'imaging micro-CT consente la visualizzazione dell'esposizione alla polpa mesiale e delle aree radiolucidali periapicali mesiali e distale del riassorbimento osseo.
Infatti, un significativo riassorbimento osseo periapicale del volume tissutale viene misurato nei denti trattati, rispetto ai controlli. L'analisi istologica indica che nel dente trattato, la polpa dentale stessa presenta necrosi, che può essere osservata chiaramente dopo la colorazione H ed E rispetto al tessuto di polpa organizzato di controllo. Inoltre, e soprattutto, nella regione periapica del dente trattato, si osserva una lesione periapicale composta da cellule immunitarie, che è assente nei denti di controllo.
È fondamentale posizionare correttamente il mouse durante l'esposizione alla polpa in quanto un corretto posizionamento consente un buon accesso alla bocca dell'animale e risultati ottimali. Ulteriori metodi di analisi dell'infiammazione periapicale come la colorazione immunoistochimica dei tessuti e il fax e l'analisi molecolare dettagliata delle cellule possono essere eseguiti seguendo questo protocollo. Questo protocollo è significativo, non solo per la ricerca dentale, ma anche per la ricerca immunologica, in quanto fornisce un modello per l'infiammazione indotta locale con un controllo interno integrato.
