Questo metodo consente lo studio sistematico dell'influenza della dimensione dei pori e della portata sullo sviluppo del biofilm in mezzi porosi naturali e artificiali, in modo da poter svelare il meccanismo fondamentale del bioclogging dei mezzi porosi. I principali vantaggi delle tecniche sono la massima risoluzione spaziale e temporale dell'alterazione e l'adattabilità della piattaforma a una serie di condizioni e requisiti sperimentali. Inizia accendendo l'incubatore del microscopio tre ore prima dell'esperimento per garantire una temperatura stabile di 25 gradi Celsius.
Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo microfluidico. Fissare il collegamento tra il tubo e la siringa inserendo un ago avente un diametro esterno di 0,6 millimetri nel tubo di ingresso. Posizionare il dispositivo microfluidico, 30 millilitri di acqua deionizzata e 30 millilitri di terreno di coltura in un essiccatore sottovuoto e degasarli per almeno un'ora.
Una volta fatto, tirare lentamente il terreno di coltura e l'acqua deionizzata in due siringhe separate da 30 millilitri. Quindi, montare il dispositivo microfluidico sul microscopio e posizionare il tubo di uscita in un contenitore per i rifiuti. Collegare la siringa riempita con acqua deionizzata al canale microfluidico attraverso il tubo microfluidico e iniettare lentamente l'acqua fino a quando non esce dall'uscita del sensore di pressione.
Riempire il sensore di pressione con acqua e lavare tutte le bolle dal tubo che collega il canale microfluidico e il sensore di pressione. Chiudere l'uscita del sensore di pressione con le viti dedicate al sensore di pressione. Riempire il resto del canale microfluidico con acqua deionizzata.
Quindi, posizionare un filtro da 1,2 micrometri sulla siringa del terreno di coltura. Rimuovere la siringa dell'acqua e collegare con attenzione la siringa al tubo microfluidico di ingresso. Dopo aver montato la siringa sulla pompa della siringa, lavare il canale con il terreno di coltura ad una portata di due millilitri all'ora per un'ora.
Successivamente, impostare la pompa a siringa sulla portata desiderata durante l'esperimento e impostare la lettura della pressione dei sensori di pressione a zero. Successivamente, pipettare un millilitro della coltura di Bacillus subtilis NCIB 3610 di una densità ottica di 0,1 a una lunghezza d'onda di 600 nanometri in una fiala di centrifuga da 1,5 millilitri. Per caricare la coltura batterica nel canale microfluidico, posizionare il tubo di uscita nel flaconcino della centrifuga e attendere cinque minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria dall'uscita del tubo.
Una volta fatto, prelevare 150 microlitri di soluzione batterica ad una portata di un millilitro all'ora fino a quando il canale microfluidico non viene riempito con la coltura batterica. Quindi, rimuovere con cautela il filtro della siringa dei terreni di coltura e posizionare l'uscita nel contenitore dei rifiuti. Lasciare le cellule batteriche in condizioni di flusso zero nel canale microfluidico per tre ore per consentire il loro attaccamento superficiale nel mezzo poroso.
Per avviare l'esperimento, avviare il flusso impostando la pompa a siringa sulla portata desiderata e avviare la lettura della pressione a un hertz prima di acquisire le immagini dei biofilm in crescita all'intervallo di tempo, alla configurazione ottica e all'ingrandimento desiderati. Il processo di formazione del biofilm è stato visualizzato utilizzando la microscopia a campo chiaro, in cui le cellule batteriche e il biofilm sono apparsi nelle immagini come pixel più scuri. Durante un esperimento di 24 ore, il biofilm inizialmente cresciuto casualmente ha colonizzato quasi l'intero mezzo poroso.
La copertura superficiale del biofilm si è verificata il 10% più velocemente alla dimensione dei pori più piccola rispetto alla dimensione dei pori più grande a 20 ore. La correlazione della copertura superficiale del biofilm con l'accumulo di pressione ha mostrato che l'intasamento nel canale microfluidico di dimensioni dei pori più piccole ha portato a una maggiore differenza di pressione tra l'ingresso e l'uscita rispetto alla dimensione dei pori più grande. Gli aspetti più importanti da ricordare sono eseguire l'esperimento in un ambiente stabile a temperatura e degasare bene il dispositivo microfluidico e le soluzioni per evitare la formazione di bolle.
Questo metodo consente studi sistematici per svelare i meccanismi fondamentali della crescita del biofilm sia in mezzi porosi industriali che naturali per quanto riguarda l'influenza della portata e della dimensione dei pori.
