Questo protocollo descrive la fabbricazione di micro barre di gel che si interconnettono in scaffold di micropori. Questi scaffold possono essere utilizzati in combinazione con le cellule che forniscono lo spazio necessario per un'interazione efficiente delle cellule cellulari. I due diversi tipi di micro barre di gel si interconnettono al contatto.
All'alto rapporto d'aspetto porta a pori più grandi mantenendo la stabilità dell'impalcatura utilizzando meno materiale sintetico rispetto ai micro gel sferici. Gli scaffold dei micropori migliorerebbero significativamente l'infiltrazione e l'interazione delle cellule endogene per riparare il tessuto danneggiato. I pori dilatati faciliteranno la formazione dei vasi sanguigni per scambiare sostanze nutritive al tessuto in crescita.
La riduzione del materiale impalcato è vantaggiosa in quanto vengono forniti più spazi aperti per la formazione dei tessuti, che è importante sia per le applicazioni in vitro che in vivo. Un aspetto critico è la microfitica sulla tecnica di chipulazione. Per garantire la produzione continua di micro barre di gel, il prodotto deve essere efficacemente trasportato fuori dal tubo senza intasamento.
Per iniziare, inserire gli aghi nei tubi di polietilene e rimuovere il gas dalla siringa e dal tubo. Quindi inserire un ulteriore tubo di polietilene nell'uscita per la raccolta del prodotto. Quindi, posizionare tutte le siringhe di vetro e le pompe a siringa e inserire ciascuna estremità del tubo nell'ingresso corrispondente.
Quindi, focalizzare il microscopio sulla sezione trasversale olio-acqua. Avviare la prima pompa della siringa dell'olio per riempire prima il canale con olio, per evitare la bagnatura del canale da parte della fase dispersa. Quindi, ridurre la prima portata dell'olio a 30 microlitri all'ora e avviare la pompa della siringa prepolimerica fino a quando la fase acquosa dispersa può essere osservata nella sezione trasversale.
Quindi, impostare la portata pre-polimero su 30 microlitri all'ora e focalizzare il microscopio sull'uscita. Quindi, avviare la seconda pompa della siringa dell'olio e attendere che il regime di flusso sia stabile. Posizionare il tubo di uscita in un contenitore di raccolta e impostare il sistema di irradiazione UV in modo tale che l'irradianza sia compresa tra 900 e 1000 milli watt per centimetro quadrato.
E il punto di irradiazione è la parte del canale dritto prima dell'uscita. Prima dell'irradiazione UV, regolare le portate del prepolimero e del primo olio per ottenere il rapporto d'aspetto desiderato nell'intervallo da 3,0 a 4,5 e impostare il tempo di irradiazione della fase dispersa a circa 2,3 secondi, a seconda delle dimensioni dello spot di irradiazione. Quindi avviare l'irradiazione UV e, se necessario, regolare nuovamente le portate in base alla sottosezione precedente.
Quindi, cambiare il contenitore di raccolta e annotare l'ora di inizio della raccolta del prodotto e le portate. Per terminare la raccolta, rimuovere il contenitore di raccolta annotando l'ora. Successivamente, interrompere l'irradiazione e tutte le pompe a siringa.
Successivamente lavare il prodotto cinque volte ciascuna con n-esano, isopropanolo e acqua deionizzata. Quindi rimuovere il surnatante dopo la sedimentazione dell'asta. Trasferire la dispersione del primo componente in un flaconcino trasparente conico da 1,5 o due millilitri.
Quindi aggiungere il secondo componente in modo controllato in un funzionamento continuo con una pipetta da 100 microlitri e mescolare il contenuto direttamente utilizzando la pipetta per assorbire il liquido e aggiungerlo nuovamente. Quindi aggiungere la soluzione G R G D S P C alla struttura interconnessa per modificare tutti i restanti gruppi epossidici con il peptide adesivo cellulare contenente un'ammina libera e un tial e lasciare a temperatura ambiente durante la notte. Quindi, rimuovere le molecole non reagite lavando con acqua deionizzata e rimuovere il surnatante.
Dopo aver ridotto il livello dell'acqua, aprire il flaconcino e deirradiare con luce UV di lunghezza d'onda, da 250 a 300 nanometri. Quindi chiudere il flaconcino e trasferire il flaconcino su un banco pulito. Successivamente, lavare con acqua sterile.
Sostituire l'acqua nel flaconcino con terreni di coltura cellulare e lasciare l'equilibrio per cinque minuti. Quindi, trasferire l'impalcatura macroporosa in una piastra di coltura cellulare per l'esperimento versando o usando una spatola. La microscopia confocale ha rivelato che il costrutto macroporoso 3D era composto da ammine interconnesse e micro barre di gel funzionalizzate epossidiche.
Il costrutto presenta una geometria compatta di circa 10.000 micro barre di gel formate in due o tre secondi. Il modulo di Young efficace di ammine e micro barre di gel epossidico insieme a sfere di ammina e micro gel epossidico viene misurato mediante nano indentazione. Per rilevare gruppi funzionali attivi, l'isotiocianato di fluoresceina può essere utilizzato per visualizzare i gruppi amminici primari e l'isomero dell'ammina fluoresceina può essere impiegato per etichettare i gruppi epossidici.
Le barre di micro gel amminico hanno dimensioni con una lunghezza media di 553 micrometri e una larghezza media di 193 micrometri in acqua deionizzata, risultando in un rapporto di aspetto di circa 3,0. I valori medi dei macro pori e degli scaffold composti da micro barre di gel sono di 100 micrometri, con il 90% delle dimensioni dei pori che vanno da 30 micrometri a oltre 150 micrometri. La sfera come micro gel, si traduce in cluster con dimensioni dei pori comprese tra circa 10 e 55 micrometri, con un valore medio di circa 22 micrometri.
Le barre di micro gel descritte sono progettate per produrre scaffold di micropori interconnessi mediante miscelazione casuale. Una procedura di miscelazione controllata potrebbe consentire la fabbricazione di geometrie di impalcature più personalizzate in futuro. La rigidità dei micro gel e dei segnali biochimici può essere variata in base alle esigenze di vendita.
Combinando diversi elementi costitutivi è possibile ottenere un'ampia varietà di geometrie e proprietà all'interno di un'impalcatura. In questo modo possiamo indirizzare cellule specifiche in modo efficiente per formare tessuti multicellulari.
