Questo protocollo serve ad abbassare una barriera all'ingresso per la sperimentazione di colture cellulari e consente ai ricercatori di valutare e caratterizzare i monostrati cellulari aderenti coltivati in ambienti microfluidici dinamici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la valutazione sia qualitativa che quantitativa delle caratteristiche del monostrato cellulare per servire come base per ulteriori sperimentazioni dipendenti dal monostrato. Questo metodo consente la ricapitolazione di un epitelio alveolare in vitro, consentendo l'esplorazione delle risposte dinamiche durante la sindrome da distress respiratorio acuto, ARDS, nonché il danno polmonare indotto da ventilatore, VILI.
Per iniziare, ottenere una matrice di flusso a canale singolo. Pulire la superficie del vetro di copertura in un bagno ad ultrasuoni. Immergere il vetro di copertura in poli-d-lisina a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi asciugarlo a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, applicare biadesivi nei distanziatori Mylar. Tagliare al laser come descritto nel manoscritto al vetro di copertina e assicurarsi che i ritagli del canale siano allineati con precisione.
Applicare un vetro di copertura rettangolare alla striscia adesiva più in basso. Utilizzare le carte adesive sbucciate per coprire le porzioni di adesivo ancora esposte. Al termine dell'assemblaggio, applicare una pressione decisa e uguale alla costruzione.
Utilizzando una siringa riempita con acqua deionizzata, sciacquare il canale. Sterilizzare l'involucro del canale in uno sterilizzatore a raggi ultravioletti per 30 minuti. Utilizzando una tecnica sterile, trattare il canale con una soluzione di fibronectina umana preparata in PBS e incubare per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Nella cappa a flusso laminare sterile, preparare la sospensione cellulare NCI H441 utilizzando il mezzo RPMI 1640 con il 10% di FBS. Utilizzare 0,25 millilitri di questa sospensione cellulare per riempire il canale e una parte delle porte. Utilizzando la microscopia a campo chiaro, verificare che le cellule siano state distribuite uniformemente all'interno dei canali.
Aggiungere il serbatoio del supporto e il rubinetto di arresto al canale. Inizia a coltivare il canale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Utilizzare una pompa a siringa programmabile per estrarre i fluidi esausti dal canale e i fluidi freschi nel canale da un serbatoio di supporti sterili collegato all'ingresso del canale.
In una cappa aspirante chimica, diluire una soluzione di formaldeide al 4% in DPBS per creare una soluzione all'1% e conservarla in un tubo opportunamente etichettato. Preparare la soluzione di formaldeide al 2% in modo simile. Trasferire le soluzioni di formaldeide in siringhe da cinque millilitri opportunamente etichettate.
Aspirare 20 millilitri di DPBS in una siringa separata da 20 millilitri che verrà utilizzata per le fasi di lavaggio. Quindi, rimuovere il canale microfluidico dall'apparato di coltura e fissarlo nella cappa dei fumi chimici. Per assemblare l'apparecchio di fissaggio e colorazione, collegare un segmento di tubo di trasferimento alla porta laterale di un rubinetto di arresto a tre vie tramite l'adattatore Luer lock to hose barb del tubo.
Quindi collegare il rubinetto di arresto alla porta di ingresso dell'array di flusso. Collegare un altro segmento del tubo di trasferimento alla porta di uscita del rubinetto di arresto esistente utilizzando lo stesso tipo di adattatore per barbetta del tubo. Infine, fissare le estremità libere di entrambi i tubi di trasferimento ora designati come linee di scarico in un contenitore per rifiuti adatto ai rischi chimici e biologici.
Assicurarsi che il rubinetto di arresto stia bloccando la porta di ingresso dell'array di flusso e lavare la linea di scarico con DPBS. Quindi ruotare il rubinetto per bloccare la linea di scarico e lavare lentamente le celle con due millilitri di DPBS. Spingere lentamente due millilitri di fissativo all'1% attraverso il canale.
Lasciare riposare per cinque minuti e ripetere con il 2% di fissativo. Quindi lavare le cellule tre volte con DPBS fresco come dimostrato in precedenza. Preparare la soluzione di saponina allo 0,1% come descritto nel manoscritto.
Aspirare un ulteriore DPBS in una siringa da 20 millilitri da utilizzare nelle fasi di lavaggio. Coprire il tubo con un foglio di alluminio. Aggiungere il reagente falloidina colorante actina filamentosa e un reagente Hoechst colorante nucleo alla soluzione di saponina allo 0,1%.
Quindi trasferire la soluzione in una siringa ricoperta di alluminio. Lavare la linea di scarico con una piccola quantità di soluzione permeabilizzante e colorante. Quindi introdurre due millilitri della soluzione nel canale microfluidico.
Coprire il canale con un foglio di alluminio per bloccare la luce. Dopo 30 minuti, lavare la soluzione permeabilizzante con due millilitri di DPBS due volte per cinque minuti ciascuno prima di asciugare delicatamente il canale. Utilizzando una micropipetta, introdurre una quantità minima di un montante anti-sbiadimento morbido sul canale microfluidico assicurando di coprire completamente la superficie inferiore.
Quindi sigillare l'estremità del canale. Utilizzando un microscopio a campo chiaro, verificare rapidamente l'integrità dello strato cellulare prima di conservare il canale in un contenitore per proteggerlo dalla luce. Testare le posizioni di imaging eseguendo scansioni di riferimento e z-stack fino a quando i parametri e le condizioni dell'immagine desiderati non sono stati soddisfatti.
Utilizzando la piastra di base dell'array di flusso come riferimento, costruite z-stack in varie posizioni lungo la lunghezza del canale. Infine, analizza i dati della sezione trasversale, i dati della mappa di profondità e qualsiasi altra caratteristica rilevante per valutare le proprietà dello strato cellulare. L'uso efficace della tecnica è dimostrato nell'ambiente di coltura microfluidica dinamica attraverso l'acquisizione di immagini ad almeno un centimetro di distanza dall'ingresso e dall'uscita.
In un esperimento rappresentativo sulla durata della coltura, è stata osservata una produzione monostrato di successo quando le cellule sono state coltivate per 24 ore. Tuttavia, quando coltivato per 48 ore, è stata osservata una formazione multistrato indesiderabile. I dati raccolti da ciascuna delle cinque posizioni di imaging dei canali microfluidici rivelano anche la relazione tra l'aumento della durata della coltura e l'aumento dell'area della sezione trasversale, suggerendo che la formazione irregolare dello strato o la crescita eccessiva si verificano entro 48 ore dalla coltura.
È stata ottenuta la mappa di profondità di una posizione centrale all'interno del canale microfluidico coltivato per 24 ore, utile per la valutazione qualitativa delle caratteristiche dello strato. I tre aspetti più cruciali di questo protocollo sono la corretta costruzione del canale, le accurate condizioni di coltura e flusso dei fluidi e l'uso attento dell'apparato di fissazione e colorazione. Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere utilizzati in parallelo per convalidare la fattibilità sperimentale dei monostrati cellulari prodotti, come il rilevamento dell'impedenza del substrato elettrico della cellula, ECIS o la resistenza elettrica transepiteliale, TEER.
