I metodi tradizionali di coltura diffusa spesso non riescono a ricapitolare il complesso ambiente degli organi viventi, portando alla perdita di marcatori e funzioni tessuto-specifici. Abbiamo sviluppato un chip open-top che combina coltura diffusa e principio microfluidico per imitare da vicino il microambiente dei tessuti epiteliali. Includendo segnali biochimici e biomeccanici che sono naturalmente presenti negli organi viventi ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro, il chip open-top rappresenta un'alternativa migliore tra i sistemi chiusi.
A dimostrare la procedura sarà oggi Adya Panchal, una studentessa di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare, portare i reagenti necessari sotto l'armadio di biosicurezza sul ghiaccio. Coltura di cellule mesenchimali tessuto-specifiche per ottenere dall'80% al 90% di confluenza e quindi dissociare le cellule usando tripsina o altri metodi secondo le raccomandazioni del produttore.
Pellettare le cellule a 250g per cinque minuti a 24 gradi Celsius. Risospendere il pellet cellulare in 225 microlitri ciascuno di EMEM 10X ghiacciato e tampone di ricostruzione. Mescolare le cellule mediante pipettaggio e aggiungere 1.800 microlitri di soluzione ghiacciata di collagene 1.
Quindi, mescolare la soluzione pre-gel su ghiaccio pipettando su e giù da cinque a sei volte. Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 microlitri di un normale idrossido di sodio, mescolare delicatamente mediante pipettaggio e quindi pipettare 150 microlitri di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip aperto evitando bolle. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, incluso un tappo a tubo da centrifuga riempito con due millilitri di acqua sterile a doppia distillazione in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per eseguire la micromodellazione superficiale dell'idrogel stromale, pipettare 20 microlitri della soluzione pre-gel Collagen 1 neutralizzata sulla superficie modellata di un timbro sterile stampato in 3D e inserire il timbro all'interno della camera aperta mentre l'idrogel stromale è ancora in forma liquida. Rimuovere qualsiasi residuo di idrogel che possa fuoriuscire dalla parte superiore della camera aperta utilizzando un aspiratore. Raggruppare tutti i trucioli in piastre di Petri separate con un tappo conico riempito d'acqua, come dimostrato in precedenza.
E incubare tutte le piastre di Petri a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 90 minuti. Al termine dell'incubazione, riportare i trucioli sotto l'armadio di biosicurezza e rimuovere delicatamente i timbri utilizzando pinzette di precisione per ridurre il rischio di danneggiare l'idrogel. Una volta che le cellule in coltura raggiungono l'80% al 90% di confluenza, dissociare le cellule utilizzando procedure enzimatiche proteolitiche come raccomandato dal fornitore di cellule.
Dopo la dissociazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere le cellule epiteliali alla densità appropriata del frammento cellulare come descritto nel manoscritto. Per seminare la cellula epiteliale, trasferire i trucioli dall'incubatore nell'armadio di biosicurezza e sciacquare la superficie stromale tre volte con 100 microlitri di terreno di coltura cellulare epiteliale fresco per rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione di rivestimento. Una volta aspirato il mezzo di risciacquo, seminare la superficie dell'idrogel con 50 microlitri di sospensione di cellule epiteliali utilizzando la densità cellulare appropriata, quindi trasferire nuovamente i trucioli nell'incubatore per due ore.
Per rimuovere i detriti cellulari, sciacquare delicatamente la superficie dell'idrogel con il terreno di coltura cellulare due volte, rinfrescare il terreno mediante autoclave in contenitori autoclavabili sigillati e collegare i trucioli alla pompa peristaltica. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre il supporto dell'alloggiamento del chip. Dopo aver trasferito i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza, rimuovere il volume del mezzo rimasto nel serbatoio superiore.
Quindi, aspirare delicatamente tutto il mezzo dal canale microfluidico superiore e bloccare il tubo microfluidico corto collegato agli ingressi superiori utilizzando clip leganti per ridurre l'evaporazione del fluido e la manutenzione dell'interfaccia aria-liquido, o ALI. Posizionare il chip aperto sul supporto dell'alloggiamento nell'incubatore. Ricollegare i trucioli alla pompa peristaltica e riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.
Risciacquare la camera vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale e quindi seminare 25 microlitri di sospensione di cellule endoteliali. Capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica. Raggruppare le patatine in piastre di Petri.
Rimetterli nell'incubatore come dimostrato in precedenza e lasciare che le cellule endoteliali si attacchino per un'ora. Alla fine dell'incubazione, trasferire i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e sciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale due volte per rimuovere i detriti cellulari. Posare i trucioli in piano per facilitare l'adesione delle cellule endoteliali alla superficie inferiore del canale vascolare.
Riempire il serbatoio del mezzo vascolare con il mezzo di coltura cellulare vascolare degassato sotto l'armadio di biosicurezza. Riposizionare i trucioli all'interno del supporto dell'alloggiamento del chip e ricollegare i trucioli ai serbatoi medi su un'estremità e alla pompa peristaltica sull'altra. Ispezionare le connessioni microfluidiche per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non siano visibili goccioline di gocciolamento medio.
Quindi, riprendere il flusso del fluido avviando la pompa peristaltica. Viene visualizzata la superficie del gel micromodellato con e senza cellule. L'analisi istologica ha rivelato epidermide stratificata multistrato matura differenziata su chip.
L'immagine in alto del chip cutaneo ha mostrato la presenza dei fibroblasti all'interno dello strato dermico. PECAM-1, VE-caderina e von Willebrand hanno mostrato la differenziazione delle cellule endoteliali microvascolari umane co-coltivate nel chip cutaneo open-top. La colorazione fluorescente di MUC5AC, alfa e beta, proteina clorocellulare 16, p63 e ZO-1 ha mostrato epitelio maturo delle vie aeree.
Le ciglia battenti e l'epitelio pseudo-stratificato maturo differenziato sono stati osservati su chip delle vie aeree open-top. La colorazione fluorescente di tipo I, tipo II ed E-caderina ha mostrato la presenza di pneumociti maturi sul chip. La microscopia elettronica ha rivelato la presenza di microvilli e vescicole lisosomiali, evidenza di fenotipo alveolare maturo.
L'analisi istologica ha mostrato la presenza di cellule squamose piatte coerenti con il fenotipo di tipo I, e cellule cuboidali simili a ciottoli coerenti con il fenotipo di tipo II e fibroblasti all'interno dello strato dermico. La presenza di enterociti e del calice maturo è stata confermata dalla colorazione con mucina 2 e E-caderina. I fibroblasti all'interno dello strato dermico hanno confermato la presenza di un semplice epitelio colonnare.
Tutti i reagenti devono essere freddi e le superfici del gel devono essere adeguatamente risciacquate per ottenere una superficie uniforme. È importante rimuovere eventuali cellule e detriti non aderenti per ottenere un'adesione cellulare uniforme e un monostrato compatto e una parete vascolare. Un approccio simile può essere impiegato per generare altri tipi di modelli di organi epiteliali, come l'intestino e il polmone, per valutare come specifici farmaci o fattori ambientali possono influenzare l'omeostasi dei tessuti umani, con particolare attenzione alla funzione di barriera epiteliale e vascolare.
Con un facile accesso alla fase di efficacia del compartimento stroma, la ricerca può ora generare modelli facciali specifici e riprodurre l'architettura funzionale del tessuto, come i cryptviveoli, che è difficile da ottenere con altri dispositivi.
