Contrariamente ad altre vie metaboliche come lo smaltimento del glucosio, la sintesi degli acidi grassi non viene valutata di routine, portando a interpretazioni incomplete dello stato metabolico. I principali vantaggi di questo metodo sono che è relativamente non invasivo ed è probabilmente un riflesso migliore del flusso di sintesi degli acidi grassi rispetto all'utilizzo di glucosio marcato con isotopi in cui i cambiamenti nella gestione del glucosio a monte possono influire sui risultati. Qui ci concentriamo sul tessuto adiposo bruno, ma questo metodo è potenzialmente utile per studiare qualsiasi tessuto in qualsiasi modello murino.
Per iniziare, posizionare i campioni su ghiaccio secco. Prendete una provetta per microcentrifuga pre-etichettata, posizionatela su una bilancia analitica e taratela. Quindi metti una pinzetta e un bisturi o una lama di rasoio in acciaio sul ghiaccio secco per 10-20 secondi per raffreddare.
Usa le pinzette per estrarre il campione di tessuto congelato dalla provetta e posizionarlo su una barca di plastica, che può essere posizionata su un blocco piatto di ghiaccio secco o su un'altra superficie preraffreddata. Usando il bisturi o la lama di rasoio in acciaio, sezionare una piccola porzione di tessuto equivalente a 5-15 milligrammi di peso e posizionarla nella provetta della microcentrifuga. Registrare il peso esatto e ripetere per ogni campione.
Aggiungere un microlitro per milligrammo di acido D31 esadecanoico da 10 millimolari, seguito da tre perle di acciaio inossidabile da cinque millimetri a ciascun campione. Quindi aggiungere 250 microlitri di metanolo, 250 microlitri di acqua e 500 microlitri di cloroformio a ciascun campione con le perle. Posizionare le provette in un blocco preraffreddato di un mulino di macinazione e mescolare i campioni a una frequenza vibrazionale di 25 hertz per cinque minuti.
Rimuovere le perle utilizzando un magnete e centrifugare i campioni a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta, prelevare un volume fisso della fase inferiore di ciascun campione in provette per microcentrifuga etichettate in modo corrispondente. Aggiungere 500 microlitri di cloroformio al campione rimanente e ripetere questi passaggi.
Posizionare le provette con la fase inferiore combinata sotto azoto gassoso o in un vuoto centrifugo refrigerato resistente al cloroformio a quattro gradi Celsius fino a completa asciugatura. Pipettare 98 millilitri di metanolo anidro in un flacone di vetro. E aggiungi lentamente due millilitri di acido solforico anidro nella cappa aspirante per produrre il 2% di acido solforico in metanolo.
Mescolare facendo roteare il flacone chiuso. Aggiungere 500 microlitri di questo acido solforico al 2% in soluzione di metanolo a ciascun campione e vorticare brevemente. Incubare i campioni sul blocco termico a 50 gradi Celsius per due ore e aggiungere 100 microlitri di soluzione satura di cloruro di sodio e 500 microlitri di esano a ciascun campione.
Agitare vigorosamente i campioni a temperatura ambiente per un minuto e lasciarli riposare per un minuto. Le due fasi dovrebbero essere evidenti dopo questo. Raccogliere la fase superiore in una nuova provetta per microcentrifuga.
Quindi ripetere l'aggiunta di esano. E dopo la separazione di fase, raccogliere i secondi campioni di fase superiore nelle stesse provette etichettate. Essiccare i campioni a temperatura ambiente sotto azoto gassoso e risospendere i campioni in 20 microlitri di esano per milligrammo di peso tissutale originale.
Trasferire immediatamente i campioni in una fiala di vetro per gascromatografia con inserto in vetro. Iniettare i campioni in un singolo spettrometro di massa per gascromatografia quadrupla per determinare l'abbondanza di esteri metilici degli acidi grassi o isotopologhi FAME. Iniettare un microlitro di campione in un ingresso split o splitless a una temperatura di ingresso di 270 gradi Celsius utilizzando l'elio come gas di trasporto.
In provette per microcentrifuga con chiusura sicura etichettate, combinare 10 microlitri di ciascun campione di plasma o quattro microlitri standard di idrossido di sodio 10 molari e quattro microlitri di acetone al 5% in acetonitrile. Eseguire questa operazione in triplice copia per ogni campione. Dopo aver incubato i campioni per una notte a temperatura ambiente, aggiungere da 450 a 550 milligrammi di solfato di sodio a ciascun campione, aggiungere 600 microlitri di cloroformio a ciascuna provetta nella cappa aspirante e vorticare vigorosamente per 15 secondi.
Centrifugare i campioni a 300 G per due minuti. Prelevare fiale GCMS in vetro etichettate con inserti in vetro e trasferire le aliquote triplicate e poi da 80 microlitri del surnatante da ciascun campione alle fiale. Tappare bene i flaconcini per l'analisi GCMS.
La percentuale di arricchimento di D2O nel plasma dei topi in più punti temporali è mostrata qui. È stato riscontrato che l'acqua corporea è arricchita nell'intervallo dal 2,5 al 6% e che un livello basale di arricchimento di deuterio nell'acqua corporea viene rapidamente raggiunto in un'ora e mantenuto per tutta la durata dello studio. La distribuzione isotopologica di massa del palmitato nel tessuto adiposo bruno dopo tre giorni di somministrazione di D2O a temperatura ambiente e termoneutralità è mostrata qui.
Questo risultato mostra un maggiore arricchimento di deuterio M1 e M2 a temperatura ambiente. In questa figura sono presentati l'arricchimento molare del tessuto adiposo bruno e l'arricchimento molare plasmatico di una serie di acidi grassi dopo tre giorni di somministrazione di D2O a temperatura ambiente e termoneutralità. L'arricchimento della temperatura più fredda è stato trovato in un'ampia gamma di acidi grassi nel tessuto adiposo bruno.
In particolare, l'arricchimento plasmatico di acidi grassi totali non segue lo stesso andamento del tessuto adiposo bruno, ma aumenta invece l'arricchimento di acidi grassi con la termoneutralità. Queste immagini rappresentano l'abbondanza totale e il palmitato sintetizzato de novo nel tessuto adiposo bruno dopo tre giorni di somministrazione di D2O. Il risultato mostra un aumento della sintesi totale di palmitato a temperatura ambiente.
Prestare attenzione quando si eseguono acidi grassi sul GCMS. Assicurarsi che il palmitato non sia sovraccaricato in quanto può fornire valori di arricchimento isotopico artificialmente elevati. Inoltre, quando si analizza l'acetone sul GCMS, assicurarsi che non vi sia alcun picco di acetone di fondo prima di eseguire i campioni, quindi eseguire gli spazi vuoti per rimuovere l'acetone nel sistema.
Questo metodo esamina gli acidi grassi totali in più classi lipidiche, ma se si desidera capire in che modo la sintesi degli acidi grassi influisce su specifiche classi lipidiche, è possibile prima separare queste classi lipidiche utilizzando la cromatografia e quindi estrarre gli acidi grassi da queste frazioni. Poiché la lipogenesi è un fattore chiave per il normale sviluppo, ma anche per molte malattie, questo protocollo può essere utile in molti campi.
