Questo protocollo è stato sviluppato per fornire un metodo robusto per la misurazione della beta-ossidazione totale degli acidi grassi mitocondriali e perossisomiali negli epatociti primari del topo. L'uso di cellule intatte mantiene l'integrità degli organelli e i meccanismi di regolazione in atto. Inoltre, l'analisi di epatociti appena isolati riduce al minimo i cambiamenti nell'espressione genica rispetto al fegato di origine.
L'intervento chirurgico può essere impegnativo. Devi essere fiducioso, diligente e concentrato. Una volta che la cannulazione ha successo, prova a rilassarti, ma presta attenzione e monitora la qualità della perfusione.
Per iniziare la procedura, spruzzare liberamente l'addome e il torace del topo anestetizzato con il 70% di etanolo. Quindi utilizzare la pinza per tirare su la pelle e la parete addominale vicino alla base dell'addome e tagliare lateralmente su entrambi i lati della linea mediana e fino al diaframma per esporre gli organi. Esporre la vena cava inferiore, o IVC, spostando l'intestino sul lato destro e capovolgendo delicatamente i lobi del fegato verso l'alto.
Inserire un piccolo oggetto cilindrico, come un cappuccio ad ago, sotto la parte posteriore del mouse per inclinare leggermente l'IVC e facilitare la cannulazione. Dopo aver avviato la pompa con tampone uno alla velocità più bassa, inserire l'ago nell'IVC. Quindi tagliare la vena porta per alleviare la pressione e consentire il drenaggio del sangue e dei tamponi di perfusione.
Prima di aumentare la portata a sette ml al minuto. Perfondere il fegato con tampone caldo uno e assicurarsi che la linea inserita nel tubo contenente tampone uno rimanga continuamente sommersa per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Mentre si verifica la perfusione, aggiungere 130 microlitri di soluzione di collagenasi per tamponare due e mescolare mediante pipettaggio con una pipetta sierologica.
Poiché il volume nel tubo contenente il buffer uno diminuisce a circa cinque ml, aggiungere lentamente cinque mL di buffer due al buffer uno mediante pipettaggio sul lato del tubo. Ripetere l'aggiunta due volte prima di aggiungere il buffer rimanente due al tubo. Interrompere la perfusione quando circa 5-10 ml di tampone due sono rimasti nel tubo.
Quindi asportare il fegato e trasferirlo nella piastra di coltura da 100 ml contenente 20 ml di tampone ghiacciato due. Sotto il cappuccio a flusso laminare, rompere delicatamente il tessuto epatico a parte usando forbici chirurgiche e pinzette. Quindi aggiungere circa 20 ml di tampone M199 ghiacciato alla sospensione degli epatociti e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 100 micron usando lo stantuffo di una siringa per promuovere delicatamente il rilascio di epatociti aggiuntivi dai pezzi di fegato più grandi.
Lavare la piastra di coltura da 100 ml e il filtro cellulare con tampone M199 per raccogliere la sospensione cellulare fino a quando il tubo di raccolta non è pieno. Quindi centrifugare la sospensione a 50 x g per due minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante prima di risospendere il pellet di epatociti in 30 ml di M199 freddo ruotando.
Ripetere il lavaggio una volta. Scongelare le soluzioni di acido palmitico e albumina sierica bovina, o BSA, prima di preparare la miscela di substrato per reazioni multiple. Aliquot 13,5 microlitri di soluzione BSA per reazione in un tubo microcentrifuga.
Dopo aver riscaldato il tubo a 41 gradi Celsius, aggiungere un microlitro della soluzione di acido palmitico da 200 mM per reazione. Ruotare vigorosamente il tubo prima e durante l'incubazione a 41 gradi Celsius per 20-30 minuti per facilitare la formazione del complesso solubile acido palmitico-BSA. Durante questo periodo, aliquote 133 microlitri di 1 M di acido perclorico che saranno utilizzati per fermare le reazioni in tubi microcentrifuga separati da 1,5 ml.
Prima di iniziare le reazioni, aliquotare e incubare 485,5 microlitri di tampone M199 per reazione in un tubo a 37 gradi Celsius per diluire il complesso radioattivo di acido BSA-palmitico preparato. Quindi erogare 750 microlitri di M199 con o senza inibitori nei tubi a fondo tondo separati da 14 ml come campioni. Durante le fasi di lavaggio degli epatociti, da 10 a 15 minuti prima di iniziare le reazioni, trasferire i tubi in un bagno d'acqua tremante impostato a 37 gradi Celsius a 180-200 rotazioni al minuto.
Se la vitalità degli epatociti è almeno del 75%, completare la preparazione della miscela di substrato trasferendo 0,8 microlitri di acido palmitico carbonio-14 per reazione al tubo microcentrifuga contenente la soluzione di acido BSA-palmitico chiarificato. Vortice prima di riportare il tubo al bagno d'acqua a 41 gradi Celsius. Immediatamente dopo la risospensione finale degli epatociti, trasferire 750 microlitri della sospensione epatocitaria a ciascuno dei tubi a fondo tondo da 14 mL nel bagno d'acqua tremante usando una pipetta da un mL e ruotare brevemente i tubi alla bassa velocità prima di trasferirli in un'incubatrice, scaglionando ogni aggiunta di 30 secondi.
Trasferire un'aliquota separata di epatociti in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per ruotare a 3000 x g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante prima di conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius per misurare la quantità totale di proteine nel campione per normalizzare i risultati. Mentre gli epatociti sono in pre-incubazione a 37 gradi Celsius, aggiungere il complesso radioattivo di acido BSA-palmitico al mezzo caldo per mantenere a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronto per iniziare le reazioni.
Per iniziare le reazioni, rimuovere gli epatociti dal bagno d'acqua e aggiungere 500 microlitri della miscela di substrato agli epatociti. Vortice le cellule a bassa velocità per cinque secondi prima di tornare al bagno d'acqua per incubare per 15 minuti. Avviare una serie di reazioni e fermarsi immediatamente per determinare la radioattività di fondo.
Trasferire e mettere da parte le aliquote duplicate da 200 a 250 microlitri della miscela di substrato rimanente in flaconcini di scintillazione da 6 mL per eseguire il conteggio. Per fermare le reazioni, rimuovere gli epatociti dal bagno d'acqua per risospesio vorticosamente a velocità moderata e quindi trasferire 400 microlitri della sospensione epatocitaria alle provette microcentrifuga contenenti acido perclorico. Tappare e ruotare immediatamente i tubi prima di ripetere la sequenza per tutti i campioni, barcollando di 30 secondi.
Dopo aver ruotato i tubi microcentrifuga da 1,5 mL a 13.000 x g per 10 minuti, trasferire 300 microlitri del surnatante in una fiala di scintillazione da 6 mL e aggiungere 4 mL del fluido di scintillazione per contare la radioattività nei campioni e le aliquote della miscela di substrato in un contatore di scintillazione. Nello studio, la perfusione epatica ha prodotto da 30 a 40 milioni di cellule per fegato, con una vitalità media dell'80% È stato anche osservato che l'abbassamento della concentrazione di glucosio nel gruppo a digiuno non ha avuto alcun effetto negativo sulla resa o sulla vitalità degli epatociti. La sospensione epatocitaria, isolata da topi maschi nutriti e a digiuno, è stata testata per la capacità di beta-ossidazione degli acidi grassi in presenza e assenza di etomoxir, un potente inibitore della CPT1 e dell'ossidazione degli acidi grassi mitocondriali.
I conteggi al minuto, o CPM, associati alla radioattività di fondo variano con il lotto di acido palmitico. Tuttavia, il CPM era ancora significativamente inferiore rispetto ai campioni incubati con la miscela di substrato. Gli epatociti isolati dai topi a digiuno mostrano un robusto aumento dei tassi di beta-ossidazione degli acidi grassi sia mitocondriali che perossisomiali.
I dati sono stati ulteriormente studiati per determinare la velocità con cui l'acido palmitico viene ossidato negli epatociti isolati dai topi nutriti e a digiuno. Impedire alle bolle di entrare nella linea. Mantenere l'ago fermo durante la perfusione.
Sii gentile quando maneggi gli epatociti. Tenerli in sospensione quando li si eroga. Gli epatociti isolati da questa procedura possono essere utilizzati come sospensione per analizzare altre vie metaboliche, come la sintesi degli acidi grassi, oppure possono essere placcati per esperimenti di coltura cellulare.
