Il protocollo descritto consente l'analisi fenotipica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo e delle cellule stromali del midollo osseo. Può essere usato per studiare le perturbazioni di queste popolazioni in diversi contesti. Rispetto ad altri metodi precedentemente descritti, questa tecnica consente l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche, in particolare nelle due aree funzionali del midollo, endostale e midollo osseo centrale, nonché cellule stromali del midollo osseo.
Per iniziare, posiziona l'animale eutanasia con la pancia in su su una capsula di Petri e spruzza con etanolo al 70%. Fai un taglio sopra l'addome usando le forbici e tira via la pelle fino alle caviglie. Afferra una delle gambe e tagliala sul fondo per separarla dall'animale usando le forbici.
Quindi rimuovere il piede dalla gamba tagliando la caviglia e posizionare la gamba in PBS 2% FBS ghiacciato. Quindi, afferrare l'osso dell'anca usando una pinzetta e tagliarlo dietro di esso per separarlo dall'animale usando le forbici. Posizionare l'osso dell'anca in PBS 2% FBS ghiacciato.
Dopo aver posizionato l'osso della gamba e dell'anca in una capsula di Petri, pulire le ossa usando un bisturi sterile. Quindi separare la tibia e il femore tagliando il ginocchio con il bisturi e posizionare le ossa pulite in PBS 2% FBS ghiacciato. Posizionare il femore o la tibia in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato e schiacciare l'osso premendolo delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello.
Quindi, pipettare la sospensione cellulare risultante su e giù usando una pipetta da 10 millilitri per omogeneizzarla e trasferirla in un tubo da 50 millilitri attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri posto sopra il tubo. Risciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo da 50 millilitri attraverso lo stesso filtro cellulare da 40 micrometri. Centrifugare il tubo da 50 millilitri a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lisi RBC a temperatura ambiente mediante pipettaggio su e giù più volte. Dopo un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS e centrifugare il tubo da 50 millilitri. Se il pellet cellulare non appare rossastro, scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione.
Dopo aver schiacciato l'osso come dimostrato in precedenza, tagliare la punta di una pipetta P1000 usando le forbici e usarla per trasferire tutto il contenuto della malta in un tubo da 50 millilitri. Quindi centrifugare il tubo da 50 millilitri a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in tre millilitri di collagenasi IV e questa soluzione di dispase-II.
Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Riempire il tubo a 25 millilitri con PBS 2% FBS e vortice da miscelare. Quindi, trasferire il contenuto in un nuovo tubo da 50 millilitri attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.
Quindi aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS al vecchio tubo da 50 millilitri e trasferire la soluzione nel nuovo tubo da 50 millilitri attraverso il filtro cellulare da 100 micrometri. Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone per lisi dei globuli rossi pipettando su e giù più volte con una pipetta. Dopo l'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, aggiungere 15 millilitri di PBS 2% FBS.
Ancora una volta, centrifugare il tubo e se il pellet cellulare non sembra rossastro dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS 2% FBS e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra inferiore a V a 96 pozzetti per la colorazione. Quindi centrifugare la piastra a 500 G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare il femore su una piastra di Petri e tagliare le estremità dell'osso usando un bisturi sterile.
Quindi lavare la parte centrale dell'osso facendo passare 100 microlitri di PBS 2% FBS attraverso l'interno dell'osso una volta da ciascun lato utilizzando una siringa da insulina da 0,5 millilitri senza volume morto e raccogliendo la soluzione in un tubo di microcentrifuga contenente un millilitro di PBS 2% FBS. Successivamente trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri etichettato come midollo osseo lavato contenente quattro millilitri di PBS 2% FBS. Schiacciare le estremità dell'osso in un mortaio con PBS 2% FBS ghiacciato premendoli delicatamente contro la parete del mortaio usando il pestello.
Una volta che la sospensione cellulare è omogeneizzata, trasferirla in un tubo da 50 millilitri etichettato come midollo osseo schiacciato attraverso un filtro cellulare di 40 micrometri. Infine, sciacquare la malta con un altro PBS 2% FBS e trasferire la soluzione nello stesso tubo. L'analisi citometrica a flusso delle cellule staminali ematopoietiche e dei progenitori multipotenti è stata eseguita nel midollo osseo totale in un topo C57BL6J giovane adulto sano.
Nell'analisi delle cellule stromali, delle cellule endoteliali e delle cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo totale, le cellule staminali mesenchimali possono essere facilmente identificate in base all'espressione del recettore della leptina e le cellule endoteliali possono essere identificate in base all'espressione di CD31 e SCA-1. Analisi citometrica a flusso di cellule endoteliali nel midollo osseo totale che mostra la discriminazione tra cellule endoteliali arteriolari e sinusoidali basata su ICAM1. La quantificazione delle cellule endoteliali del midollo osseo arterioso e sinusoidale nel tessuto midollare centrale ed endostale mostra che le cellule endoteliali del midollo osseo arterioso sono più abbondanti nelle regioni endosteali, mentre i sinusoidi sono più frequenti nelle aree del midollo osseo centrale.
Quando si ottiene il midollo osseo arrossato, il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l'interno della parte centrale dell'osso non deve essere superato. La combinazione del metodo descritto con saggi funzionali delle popolazioni cellulari fenotipicamente analizzate fornirebbe ulteriori preziose informazioni sulle potenziali perturbazioni di queste popolazioni che si verificano nelle condizioni studiate. Il protocollo descritto consente l'analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche in modo differenziale nell'endostea e nel midollo osseo centrale, consentendo ai ricercatori di studiare le perturbazioni dell'ematopiesi che potenzialmente si verificano specificamente in queste posizioni del midollo osseo.
