Questo protocollo descrive come indurre l'autofagia nel corpo grasso larvale della Drosophila melanogaster attraverso l'esaurimento degli aminoacidi e come analizzare le differenze nell'autofagia tra i cloni mutanti. Poiché l'autofagia è altamente sensibile alla disponibilità di nutrizione in condizioni di coltura, l'analisi clonale, un metodo che analizza le cellule mutanti rispetto alle cellule di tipo selvatico nello stesso tessuto, ha un vantaggio nel sezionare i difetti dell'autofagia. Inizia introducendo tre maschi e 15 mosche adulte femmine in una fiala di coltura con farina di mais standard o melassa o agar Drosophila media a 25 gradi Celsius per l'accoppiamento.
A 48 ore dall'induzione, picchiettare la fiala di accoppiamento fino a quando le mosche non sono stordite e cadere sul supporto alla base del flaconcino. Scollegare il flaconcino di accoppiamento e coprirne la bocca con un flaconcino di coltura invertito scollegato con un terreno fresco. Quindi capovolgere e picchiettare le fiale per trasferire le mosche nella fiala di coltura fresca.
Collegare il flaconcino di coltura fresca ed eliminare il vecchio flaconcino. Posizionare la fiala di coltura fresca in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per la deposizione delle uova sui terreni freschi. Rimuovere le mosche dopo sei ore di deposizione delle uova e scartare le mosche gettandole in un pallone contenente il 75% di etanolo.
Incubare la fiala con embrioni a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un'ora per indurre l'espressione di flippasi. Successivamente, metterli in un incubatore a 25 gradi Celsius e consentire agli embrioni di continuare a svilupparsi. Utilizzando una spatola da laboratorio, raccogliere i terreni contenenti le larve in via di sviluppo in una capsula di Petri 75 ore dopo la deposizione delle uova.
Aggiungere 1X PBS al piatto e separare delicatamente i terreni di coltura e le larve usando una pinza lunga. Quindi selezionare da 10 a 15 larve di terzo stadio precoce. Riempire i pozzetti di una piastra spot di depressione di vetro a nove pozzetti con 1X PBS e posizionare le larve di terza stella separate nei pozzetti usando una pinza lunga.
Lavare accuratamente le larve per rimuovere tutti i residui di media. Prendi cinque millilitri di soluzione di saccarosio al 20% in una fiala vuota e metti le larve pulite del terzo stadio in questa soluzione usando una pinza lunga. Incubare questa fiala in un'incubatrice a 25 gradi Celsius per sei ore prima di raccoglierle per la dissezione.
Aggiungere 1X PBS in ciascun pozzetto della piastra spot di depressione di vetro a nove pozzetti e trasferire le larve nei pozzetti con una pinza lunga. Metti una larva in un pozzo con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Afferrare la cuticola della larva con due pinze da 5 nel mezzo del tronco larvale e strappare delicatamente le cuticole.
I corpi grassi esposti, insieme ad altri tessuti larvali interni, saranno ancora attaccati alla carcassa della larva. Tirare abbastanza per esporre gli organi interni il più possibile. Ripeti questo passaggio per tutte le larve.
Trasferire la carcassa larvale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di 4% di PFA e incubare per 30 minuti a 25 gradi Celsius senza agitare i tubi. Dopo 30 minuti, pipettare la soluzione PFA. Aggiungere 500 microlitri di 1X PBS nel tubo.
Agitare delicatamente il tubo su un rotatore piatto per 10 minuti, quindi gettare la soluzione 1X PBS. Ripeti questa operazione tre volte. Usando una pinza lunga, trasferire la carcassa larvale fissa e lavata in un pozzo nella piastra spot a nove depressioni riempita con 1X PBS.
Rimuovere tutti i tessuti del corpo non grassi con 5 pinze. Infine, montare i pezzi del corpo grasso su un vetrino da microscopio usando l'80% di glicerolo come mezzo di montaggio e appoggiare un coprivetrino sulla parte superiore. Il mutante uno e il mutante due sono due mutanti letali indipendenti sul cromosoma X e le mosche FRT 19A bianche gialle isogeneizzate fungono da controllo qui.
I modelli GFP-Atg8a sono stati analizzati nei corpi grassi larvali di controllo, mutanti o mutanti due mosaici, e i cloni mutanti o cloni di controllo sono stati contrassegnati negativamente da RFP. Nei cloni di controllo, i pattern di GFP-Atg8a Puncta erano simili a quelli delle cellule RFP positive circostanti. Nei cloni mutanti di uno mutante, i Puncta GFP-Atg8a erano notevolmente ridotti.
E in due cloni mutanti, il numero e le dimensioni di GFP-Atg8a Puncta sono stati aumentati. La fase di sviluppo delle larve è critica qui. Il tempo per lo sviluppo e la durata della fame devono essere modificati in base alle ricette del terreno di coltura di ciascun laboratorio.
Questa procedura può essere applicata per esplorare l'autofagia selettiva. Ad esempio, la mitofagia può essere monitorata nei corpi grassi di mosca attaccando una proteina fluorescente a una sequenza di targeting mitocondriale.
