Il complesso sinaptonemale è un componente chiave per la meiosi. Per studiare la sua funzione, dobbiamo anche capire la sua struttura per la quale la microscopia a super risoluzione si è rivelata incredibilmente utile. Abbiamo ottimizzato il nostro protocollo per attaccare stabilmente la gonade di C.elegans immunocolorata a un coprivetrino che aiuta a migliorare la risoluzione fino a 30 nanometri nei tessuti intatti.
La progettazione di esperimenti di microscopia di localizzazione di singole molecole, la successiva analisi e anche l'interpretazione dei dati possono essere piuttosto impegnativi e dovrebbero essere meglio impostati insieme a un esperto. A dimostrare la procedura sarà Ivana Cavka, borsista pre-dottorato in laboratorio. L'acquisizione delle immagini al microscopio di localizzazione di singole molecole sarà mostrata anche da Rory Power, ingegnere ottico presso l'MBL Imaging Center.
Inizia raccogliendo vermi Caenorhabditis elegans di pari età dalle piastre di agar NGM. Trasferire i vermi in una goccia da 30 microlitri di EBTT su un vetrino. Lavare i vermi con ulteriori 30 microlitri di EBTT.
Rimuovere 30 microlitri della soluzione lasciando una goccia da 30 microlitri con i vermi sul vetrino. Utilizzare una lama di bisturi per tagliare le teste dei vermi e / o le code per estrudere la gonade. In una dissezione di successo, il tessuto gonade sarà completamente estruso al di fuori del corpo del verme.
Pipettare 30 microlitri della soluzione fissativa nella goccia dei vermi sezionati. Mescolare mediante pipettaggio e lasciare fissare i campioni per un minuto. Interrompere la fissazione esattamente dopo un minuto trasferendo i vermi utilizzando una pipetta da 20 microlitri su una provetta PCR riempita con TBST.
Quindi eseguire un lavaggio facendo girare i campioni sezionati su una mini centrifuga da banco. Una volta rimosso il surnatante risospendere i vermi in 200 microlitri di TBST fresco. Dopo il lavaggio finale, risospendere i vermi in 200 microlitri di PBST e posizionare il tubo PCR sul ghiaccio.
Girare i campioni sezionati su una mini centrifuga da banco e rimuovere il surnatante. Aggiungere da 50 a 100 microlitri di metanolo freddo, mescolare mediante pipettaggio e lasciare i campioni in metanolo per 30-60 secondi sul ghiaccio. Lavare i campioni due volte con 200 microlitri di PBST.
Dopo aver girato i campioni e rimosso il surnatante, aggiungere la soluzione bloccante ai campioni e tenerla a temperatura ambiente per 45-60 minuti. Diluire gli anticorpi primari alle soluzioni di lavoro nel tampone bloccante. Ruotare i campioni su una mini centrifuga da banco, rimuovendo la soluzione bloccante e aggiungere da 30 a 50 microlitri della soluzione anticorpale primaria.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBST. Diluire i due frammenti Fab prime etichettati per le soluzioni di lavoro nel buffer di blocco.
Dopo il terzo lavaggio, ruotare i campioni, rimuovere il surnatante e aggiungere da 30 a 50 microlitri della soluzione anticorpale secondaria. Posizionare il campione in una camera buia e incubare per 30 minuti a due ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i campioni tre volte con PBST per cinque a 15 minuti.
Ruotare i campioni macchiati e rimuovere il surnatante. Aggiungere 50 microlitri di PBST e trasferire i vermi macchiati su un vetrino. Pipettare da 5,7 a 6,3 microlitri della soluzione post-fissativa su un coprivetrino di poli-l-licina.
Pipettare i vermi sezionati nello stesso volume e trasferire nella goccia di fissativo sul coprislip di poli-l-lisina. Coprire il campione con un piccolo vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta da filtro e fissare il campione per tre-cinque minuti in una camera buia.
Congelare i campioni posizionandoli su un blocco di alluminio in ghiaccio secco. Dopo almeno 20 minuti, rimuovere il coprislip più piccolo usando un rasoio. Immergere il coperchio in un tubo conico da 50 millilitri contenente PBS ghiacciato o metanolo refrigerato a meno 20 gradi Celsius per circa 10 secondi.
Posizionare il coprislip in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti riempita con tampone PBST. Rimuovere il PBST dal pozzetto, aggiungere PBST fresco e lasciare il campione per cinque minuti. Dopo il lavaggio con PBST ancora una volta, lasciare i campioni a quattro gradi Celsius fino all'imaging.
Prima dell'imaging, valutare la qualità del montaggio del campione al microscopio stereo. Se si utilizza il portacampioni personalizzato mostrato qui, avvolgere l'anello magnetico con parafilm, quindi preparare un millilitro di tampone di imaging. Prendi un foglietto di copertura dalla piastra a sei pozzetti.
Inserirlo nel supporto su misura e fissare il coprislip nel supporto con l'anello magnetico avvolto in parafilm. Pipettare delicatamente il tampone di imaging nella camera creato dall'anello magnetico sulla parte superiore del campione e sigillare la camera utilizzando il parafilm. Per montare il campione, aggiungere una goccia di olio ad immersione all'obiettivo dell'olio pulito.
Senza introdurre aria nell'olio ad immersione, posizionare delicatamente il portacampioni con il campione montato sul palco del microscopio. Utilizzando la finestra del plug-in EMU all'interno di MicroManager 2, spostare lo stadio piezoelettrico fino a quando il segnale del laser di blocco della messa a fuoco non viene rilevato sul fotodiodo del quadrante. Acquisire un'immagine del piano focale posteriore a potenza inferiore con un laser a 640 nanometri di eccitazione per confermare l'assenza di bolle d'aria nell'olio di immersione.
Localizzare il tessuto gonadico utilizzando l'illuminazione a campo chiaro. Utilizzando un'illuminazione a bassa intensità a 640 nanometri, concentrarsi sulla sezione di tessuto contenente molti complessi sinaptonemali. Procedere ad esporre il campione ad alta irradianza con illuminazione a 640 nanometri per circa 30 secondi fino a raggiungere una velocità di lampeggio appropriata.
Acquisite 200.000 fotogrammi con un tempo di esposizione di 20 millisecondi utilizzando lo strumento di acquisizione multidimensionale di MicroManager 2. Nel frattempo, imposta l'attivazione UV utilizzando l'opzione di attivazione del plug-in EMU per mantenere la velocità di lampeggio desiderata. Il piano più basso dei nuclei meiotici contenenti complessi sinaptonemali è stato visualizzato all'interno di una gonade di Caenorhabditis elegans utilizzando la colorazione HTP-3 e SYP-5.
Gli assi cromosomici nel C-terminale di SYP-5 HA erano ben risolti in tutte e tre le dimensioni in complessi sinaptonemali situati vicino al coprifoglio. Tuttavia, la risoluzione si deteriora nei complessi sinaptonemali situati a una distanza di cinque micrometri dal vetrino di copertura a causa della diffusione della luce e delle aberrazioni sferiche. Le immagini acquisite a diverse distanze piezoelettriche dal vetrino hanno rivelato che il tessuto ripreso non deve trovarsi a più di due micrometri dal vetrino.
Il protocollo di preparazione del campione può essere utilizzato anche con la microscopia TauSTED. Con la preparazione ottimizzata del campione, HTP-3 negli assi cromosomici e i C-termini di SYP-5 nella regione centrale sono stati risolti in vista frontale e vista leggermente inclinata. Per ottenere la migliore risoluzione, le gonadi devono essere strettamente reticolate al coprivetrino per garantire che i complessi sinaptonemali non distano più di due micrometri dal coprivetrino.
Utilizziamo questo protocollo non solo per la microscopia di localizzazione di singole molecole, ma anche per la microscopia a deplezione ad emissione stimolata. Può anche essere utile per altre tecniche di microscopia a super risoluzione.
