Questo protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di maturare hiPSC-CMs commerciali o in-house in un fenotipo adulto che migliora significativamente il valore predittivo delle hiPSC-CMs nello screening della cardiotossicità. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce hiPSC-CM maturi in un formato ad alta produttività per la mappatura ottica del calcio o della variazione di tensione. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi della malattia o per lo screening di farmaci per la cardiotossicità.
A dimostrare la procedura sarà Jeffrey Creech, un ricercatore associato del mio laboratorio. Iniziare lavando la matrice extracellulare che induce la maturazione, o MECM, piastre due volte con 200 microlitri di soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, 1 ora prima della placcatura cardiomiocitaria. Mantieni i pozzetti idratati.
Trasferire i tubi cardiomiocitari dal serbatoio di azoto liquido al ghiaccio secco e rilasciare la pressione aprendo leggermente i tappi del tubo. Quindi, richiudere i tappi del tubo e scongelarli a bagnomaria per 4 minuti. Dopo lo scongelamento delle cellule, spruzzare i tubi con etanolo al 70% prima di aprirli.
Trasferire le celle in tubi conici da 15 millilitri con una pipetta da 1 millilitro. Aggiungere 1 millilitro di mezzo di placcatura al crioviale e trasferire il lavaggio nel tubo conico da 15 millilitri. Quindi, gocciolare lentamente 1 millilitro di mezzo di placcatura e agitare il tubo.
Ripetere l'operazione fino al trasferimento di 8 millilitri di mezzo di placcatura. Centrifugare il tubo da 15 millilitri a 300 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 1 millilitro del mezzo di placcatura. Rimuovere un'aliquota ed eseguire il conteggio delle cellule vive con un emocitometro prima di aggiungere un mezzo di placcatura per ottenere 7,5 x 10 alla 5a cellula per millilitro.
Erogare 100 microlitri della sospensione cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestita MECM utilizzando una pipetta multicanale e incubare le celle per 2 giorni. Quindi, sostituire il mezzo con 200 microlitri di mezzo di manutenzione e mantenere le piastre per 7 giorni, con un cambio di mezzo il giorno 5. Il giorno 7, eseguire il test EP, come descritto nel testo.
Assicurarsi di cambiare il terreno a giorni alterni quando si opta per l'estensione della coltura cellulare. Per purificare l'hiPSC-CM tramite la selezione cellulare attivata magneticamente, o MACS, aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule con 1 millilitro di HBSS-Quindi, dissociare le cellule aggiungendo 1 millilitro di 0,25% tripsina-etilendiamminotetraacetico, o EDTA, e incubare le cellule per 10 minuti. Quindi, inattivare la tripsina / EDTA reinviando e singolarizzando le cellule con 2 millilitri di mezzo di placcatura.
Dai sei pozzetti, raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando un filtro da 70 micrometri. Dopo aver lavato il colino con 3 millilitri di mezzo di placcatura, contare le celle. Dopo il conteggio, centrifugare e lavare il pellet cellulare con 2 millilitri di tampone di separazione MACS ghiacciato prima di pellettare e inviare nuovamente le celle in 80 microlitri di tampone di separazione MACS freddo per 5 x 10 alle celle 6th.
Aggiungere 20 microlitri di cocktail freddo di deplezione non cardiomiocitaria e mescolare la sospensione prima di incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Dopo aver lavato le celle con 4 millilitri di tampone di separazione MACS freddo a 300 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone di separazione MACS freddo. Aggiungere 20 microlitri di microsfere fredde anti-biotina per 5 x 10 alle 6 cellule e mescolare delicatamente la sospensione cellulare prima di incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
Durante l'incubazione dei campioni, posizionare le colonne di esaurimento positivo dotate dei filtri di pre-separazione da 30 micrometri sul separatore MACS e posizionare i tubi di raccolta da 15 millilitri etichettati sotto le colonne. Quindi, innescare ogni colonna con 3 millilitri di buffer di separazione MACS freddo. Mescolare la sospensione cellulare trattata con anticorpi con 2 millilitri di tampone di separazione MACS e aggiungerlo alla colonna.
Aggiungere 2 millilitri di tampone di separazione MACS a ciascuna colonna e raccogliere 12 millilitri di sospensione cardiomiocitaria flowthrough. Centrifugare i cardiomiociti e scartare il surnatante prima di risospendere i cardiomiociti in un mezzo di placcatura da 1 millilitro. Per determinare la concentrazione, contare le cellule e regolare il volume alla densità di semina desiderata prima di placcare le cellule cardiomiocitarie purificate sulle piastre MECM a 96 pozzetti.
Aspirare e sostituire il mezzo di mantenimento dei cardiomiociti con 100 microlitri di coloranti sensibili alla tensione, o VSD, o fluorofori sensibili al calcio, o CSF, per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo 30 minuti di incubazione, sostituire i coloranti con un mezzo di analisi o HBSS. Equilibrare le celle a 37 gradi Celsius prima di acquisire la mappatura ottica dei dati di base utilizzando un dispositivo di mappatura ottica ad alta produttività.
Per trattare le cellule con farmaci per test di esposizione acuta o mappare le cellule cronicamente esposte a farmaci di interesse, diluire i farmaci in dimetilsolfossido o DMSO e conservarli come soluzioni madre a 20 gradi Celsius prima di diluirli in HBSS alle concentrazioni desiderate. Per i test di cardiotossicità in piastre a 96 pozzetti, aggiungere quattro dosi di un composto con almeno otto pozzetti per dose. Utilizzare dosi che vanno da sotto a sopra la concentrazione plasmatica terapeutica clinicamente efficace, compresa la dose efficace.
Analogamente alle misurazioni elettrofisiologiche di base prima dell'applicazione del farmaco, acquisire registrazioni elettrofisiologiche almeno 30 minuti dopo il trattamento farmacologico per gli studi cronici. Dopo le registrazioni basali, applicare almeno quattro dosi di ciascun farmaco ai monostrati hiPSC-CMs maturi che esprimono GCaMP6m, con almeno otto pozzetti per dose. Equilibrare i farmaci sulle cellule per 30 minuti e riscaldare le cellule a 37 gradi Celsius prima e durante l'acquisizione dei dati.
Dopo le registrazioni basali di un'intera piastra, aggiungere 500 isoproterenolo nanomolare a ciascun pozzetto per consentire dati di risposta al farmaco robusti e quantificare gli effetti dell'isoproterenolo sulla frequenza di battito monostrato, sull'ampiezza della contrazione e sulla durata transitoria del calcio. Per acquisire i dati di mappatura ottica, aprire il cassetto anteriore e posizionare la piastra sul riscaldatore a piastre. Dopo aver aperto il software di acquisizione e determinato la posizione di salvataggio dei file nel software, selezionare la durata da 10 a 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi di acquisizione per una risoluzione temporale più elevata, quindi fare clic su Avvia acquisizione.
Aprire il software di analisi e, nella scheda Filtro di importazione, selezionare Cerca un singolo file o Affianca multiplo per ricostruire una lastra. Selezionare i file e immettere un numero di righe e colonne, quindi selezionare Automatico. Quindi, seleziona Aggiorna dimensione pixel, inserisci la distanza per pixel e utilizza la Creazione guidata pozzo per determinare la posizione dei pozzi nell'immagine prima di fare clic su Elabora salvataggio e passare alla scheda successiva.
Apri la scheda ROI o Regioni di interesse e scegli di disegnare i ROI manualmente, automaticamente o di non utilizzare affatto i ROI, che verranno considerati per l'analisi dell'intera piastra. Dopo aver selezionato la regione nel rizzetto, fare clic sul pulsante Elabora salvataggio per passare al passaggio successivo. Seleziona Nascondi pozzetti e Mostra solo caselle filtrate per visualizzare i ROI.
Apri la scheda Analisi, seleziona ciascun pozzetto o ROI per confermare l'accuratezza del rilevamento automatico dei battiti. Aggiungere o rimuovere battute dalle tracce selezionando una singola battuta e premendo Canc sulla tastiera. Una volta fatto, fai clic su Salva.
Quindi, fare clic sul pulsante Grafico spazio-tempo nella scheda Analisi e aggiungere la linea per determinare il grafico spazio-tempo per visualizzare i dati per ciascun pozzo o il ROI. Dopo aver selezionato una linea orizzontale o verticale, fare clic su Genera plot. Dopo esserti assicurato il rilevamento accurato dei battiti, vai alla scheda Esporta e seleziona Formato file, inserisci l'opzione Statistiche battiti prima di fare clic su Esporta.
Una volta esportati, apri i file di dati ed esegui la routine di analisi statistica scelta. L'imaging a contrasto di fase ha mostrato che gli hiPSC-CM placcati sul MECM maturavano e diventavano strutturalmente distinti dallo stesso lotto di hiPSC-CM riplaccati sull'ECM del topo. Le cellule mature sono diventate a forma di bastoncello, mentre le cellule immature hanno mantenuto una forma circolare.
I cardiomiociti colorati con anticorpi alfa-actina hanno mostrato la forma tipica delle cellule coltivate su ciascuna condizione di ECM. Coerentemente con la colorazione TnI, la colorazione alfa-actina ha indicato che gli hiPSC-CM maturati sul MECM hanno promosso un fenotipo maturo a forma di bastoncello e hanno indotto una maggiore organizzazione del sarcomero. Il contenuto e l'attività mitocondriale erano distinti tra le cellule coltivate sul topo ECM e la MECM.
I dati elettrofisiologici per i potenziali d'azione registrati utilizzando VSD e il sistema di mappatura ottica hanno mostrato che le cellule atrial-specifiche hanno una frequenza di battito spontaneo significativamente più veloce e una durata del potenziale d'azione più breve, o APD80, rispetto alle cellule ventricolari specifiche. Le mappe di calore dell'intera piastra per parametri come APD80 hanno rivelato la riproducibilità di un determinato parametro all'interno di una piastra. I potenziali d'azione tipici dei monostrati hiPSC-CM maturi hanno indicato la morfologia del potenziale d'azione dei cardiomiociti adulti isolati e testati.
È stato anche mostrato un tipico ritmo spontaneo del potenziale d'azione. In risposta all'isoproterenolo, l'attivazione dei recettori beta-1-adrenergici ha causato cronotropia positiva, inotropia positiva e lusitropia positiva. La risposta HiPSC-CM al gene umano correlato all'etere correlato, o hERG, bloccante dei canali, tra cui E-4031, domperidone, vandetanib e sotalolo, è stata studiata utilizzando la fluorescenza del calcio GCaMP6m per monitorare il ritmo.
Lo studio ha mostrato il rilevamento delle prime depolarizzazioni post-depolarizzazioni causate dal blocco del canale E-4031 hERG. Lavorare velocemente con le celle in sospensione ed evitare lo stress da taglio pipettando delicatamente le cellule. Inoltre, eseguire la sostituzione dei supporti con attenzione per evitare di danneggiare la sincizia hiPS.
Seguendo questa procedura, le cellule sono suscettibili per la raccolta di proteine, RNA, DNA e lipidi per l'analisi con la tecnica preferita dai ricercatori. La tecnica consente ai ricercatori di studiare le malattie e testare la cardiotossicità di nuovi farmaci utilizzando cardiomiociti simili agli adulti.
