Questo protocollo è per l'affezione e la coltura di sezioni di tessuti cardiaci per sei giorni in condizioni fisiologiche che possono essere utilizzate per test di tossicità cardiaca acuta e per testare l'efficacia delle terapie per insufficienza cardiaca. Questo sistema di coltura ha il potenziale per diventare un potente modello predittivo in situ umano per test di tossicità cardiaca acuta che colma il divario tra i risultati dei test precli clinici e clinici. A dimostrare le procedure sarà Qinghui Qu, un responsabile di laboratorio del nostro laboratorio.
Per ottenere fette di tessuto cardiaco suino, aggiungere prima ghiaccio alla giacca di raffreddamento del bagno di tessuto di un vibratomo e aggiungere la soluzione Tyrode al bagno. Utilizzare un barattolo di plastica da un litro per raccogliere il deflusso di ghiaccio fuso dalla giacca di raffreddamento del bagno di tessuto e trasferire il cuore del maiale in un vassoio contenente un litro di soluzione cardioplegica fredda fresca in un armadietto di biosicurezza. Utilizzare bisturi sterili retrattili per sezionare il cuore per isolare il ventricolo sinistro e utilizzare lamette rettangolari per tagliare il ventricolo sinistro in blocchi da uno a due centimetri cubi.
Mettere da parte un blocco di tessuto per l'affettare e posizionare i restanti pezzi di blocco di tessuto in un tubo da 50 millilitri di soluzione di tiroide freddo sul ghiaccio. Massaggiare delicatamente il blocco tissutale riservato e aggiungere da una a due gocce di colla tissutale al portacampioni metallico del vibratoma. Attaccare un pezzo di blocco di agar al 4% con una superficie di circa un centimetro quadrato alla colla e aggiungere una o due gocce di colla tissutale all'agar.
Attaccare il blocco cardiaco al lato epicardio cardiaco dell'agar verso il basso con il tessuto il più piatto possibile contro il supporto e posizionare il porta tessuto con il blocco cardiaco nel bagno di affezione del vibratomo. È fondamentale attaccare il blocco cardiaco all'agar con il lato epicardio cardiaco rivolto verso il basso sulla colla tissutale e assicurarsi che il tessuto sia il più piatto possibile. Quindi attaccare il tubo dell'ossigeno al bagno di affettare e il vassoio metallico riempito con soluzione tyrode e posizionare filtri cellulari da 40 micrometri sul vassoio metallico per raccogliere le sezioni del tessuto cardiaco mentre vengono tagliate.
Utilizzare il software operativo vibratomo per regolare l'altezza della lama e del campione in modo che la lama sia vicina alla parte superiore del tessuto ma sotto i muscoli papillari e il liquido copra il tessuto e la lama. Selezionare anticipo per regolare da dove iniziare a affeggiare il tessuto. Premere una fetta per aumentare la velocità e utilizzare la manopola per spostare la lama verso il bordo del tessuto.
Premere di nuovo slice per arrestare e avanzare per disattivare il processo. Quindi regolare i parametri di taglio come indicato e premere la fetta per iniziare a affettare il tessuto. Quando la lama raggiunge la fine del tessuto ma prima che colpisca la fine del supporto del campione, premere di nuovo la fetta per fermarsi e premere di nuovo per tornare alla posizione iniziale.
Quando le fette raggiungono l'intera lunghezza e sembrano essere di buona qualità, utilizzare una pipetta Pasteur in plastica riempita con soluzione tyrode fredda per raccogliere delicatamente il tessuto dal bagno usando forcelle e forbici a molla per dislocare la fetta dal cuore se necessario. Posizionare ogni fetta raccolta in un filtro a singola cella nel bagno tiroide ossigenato e utilizzare la soluzione nella pipetta per premere il tessuto sulla superficie del filtro cellulare. Quindi posizionare una rondella metallica sulla parte superiore del tessuto per tenerla premuta.
Dopo almeno un'ora in soluzione tiroide ossigenata, tagliare l'esterno di ogni fetta per rimuovere eventuali bordi irregolari e incollare l'estremità di ogni fetta su un pezzo largo sei millimetri di nastro di temporizzazione della stampante in poliuretano sterilizzato con fili metallici incorporati. Posizionare le fette cardiache supportate in piastre a sei po 'contenenti sei millilitri di mezzo di coltura per pozzo e utilizzare forcelle sterili per assicurarsi che il tessuto sia al centro del pozzo. Fare attenzione che il coperchio della piastra non tocchi il tessuto e posizionare la piastra sulla piastra di coltura in modo che il lato curvo del coperchio della piastra corrisponda al lato angolato della piastra e che gli angoli quadrati si allievano.
Posizionare le fette in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5%. Sostituire i supernaganti di coltura con sei millilitri di coltura fresca ossigenata media tre volte al giorno. Collegare il coperchio allo stimolatore elettrico di coltura cellulare e regolare lo stimolatore per fornire continuamente 10 volt di elettricità e una frequenza di 1,2 hertz alle fette cardiache.
Dopo aver collegato la stimolazione, le fette cardiache inizieranno a battere. Ogni giorno durante il cambiamento del mezzo di mezzogiorno, sostituire il coperchio della piastra di stimolazione dal piatto di coltura per evitare il rilascio di particelle tossiche di grafite nel mezzo di coltura. Inserire il tappo di schiuma bianca in cui il coperchio utilizzato si collega al cavo per lo stimolatore elettrico di coltura cellulare per prevenire danni causati dall'acqua al circuito elettrico e posizionare il coperchio della piastra in un bagno di acqua autoclavata integrato con 2X antibiotico / antimicotico.
Il giorno successivo, decontaminare il coperchio della piastra in un bagno di etanolo del 70% per cinque-15 minuti prima di trasferire il coperchio in un bagno d'acqua autoclavato fresco integrato con 2X antibiotico / antimicotico per tre minuti. Dopo aver risciacquato il coperchio della piastra, utilizzare una salvietta pulita senza pelucchi spruzzata con etanolo per rimuovere l'acqua residua dalle parti in plastica e rimuovere il tappo di schiuma bianca. Il coperchio è quindi pronto per essere riposto nella piastra di coltura.
Utilizzando questa nuova impostazione di coltura biomimetica come dimostrato, la vitalità delle fette cardiache dei suini è stata mantenuta per sei giorni come valutato dal saggio MTT. Nei primi sei giorni, simili alle risposte osservate per le fette cardiache fresche, non ci sono transitori spontanei di calcio all'interno della fetta di cuore di maiale cardiomiociti. I cardiomiociti hanno risposto alla stimolazione elettrica esterna e beta-adrenergica.
Inoltre, la forza contrattile e le risposte all'isoproterenolo sono state mantenute nella coltura delle fette cardiache per un massimo di sei giorni simile a quella osservata nelle fette di cuore fresco. Diverse valutazioni strutturali e funzionali possono essere eseguite sulle fette cardiache tra cui saggi di vitalità MTT, immunostaining, microscopia elettronica, misurazioni transitorie di calcio, valutazioni della funzione contrattile, valutazioni metaboliche e analisi. Attualmente stiamo utilizzando questo sistema di coltura per testare la tossicità cardiaca acuta e l'efficacia dei farmaci e delle terapie geniche di interesse per le fette di maiale e cuore umano.
