Questo metodo consente agli utenti di tracciare facilmente le cellule T in vivo per valutare la cinetica dell'homing e monitorare la persistenza delle cellule T. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere ripetuta in più punti temporali sullo stesso animale senza richiedere sacrifici nella citometria a flusso o nell'immunoistochimica. Questa tecnica potrebbe essere modificata per tracciare anche altri tipi di cellule immunitarie.
Per coltivare le cellule 293T, preparare un litro di DMEM aggiungendo 110 millilitri di siero bovino fetale inattivato dal calore e 11 millilitri di streptomicina penicillina. Scongelare cinque volte 10 fino alla sesta cella 293T e trasferirle in un matraccio T175 contenente DMEM. Dividere le cellule da una a 10 ogni tre giorni per sei giorni prima che le cellule diventino più del 90% confluenti.
Per la trasfezione, trasferire 1,5 millilitri di supporto in due tubi da 50 millilitri utilizzando una pipetta. A un tubo, aggiungere 10 microgrammi di plasmide VSVG, 20 microgrammi di gag pol e 20 microgrammi di click beetle red TDtomato o CBRTDR luciferasi plasmide e mescolare. Aggiungere 100 microlitri di reagente di trasfezione in vitro del DNA in un'altra provetta e mescolare.
Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Durante l'incubazione, staccare le cellule 293T aggiungendo da cinque a 10 millilitri di tripsina allo 0,05%. Una volta staccate le cellule, aggiungere 10 millilitri di terreno e centrifugare a 800 G per cinque minuti. Risospendere le celle in 1,5 millilitri di supporto.
Aggiungere i mezzi contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione in un matraccio T175. Aggiungere 18 millilitri di supporto e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle e sostituirlo con 18 millilitri di mezzi freschi. Ancora una volta, incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa su ghiaccio e centrifugare a 800 G per cinque minuti per pellettare le cellule e i detriti.
Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 micron e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Per l'attivazione in vitro di cellule T umane, aggiungere 10 millilitri di PBS contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina o BSA e due EDTA millimolari a un tubo sterile da 15 millilitri. Quindi per lavare le perline, aggiungere perline in un tubo e posizionare il tubo in un rack magnetico.
Dopo due minuti, rimuovere il PBS dal tubo. Dopo aver preparato DMEM, aggiungere perline lavate e interleuchina-2 o IL-2 a una concentrazione finale di 30 unità internazionali per millilitro. Contare le cellule T usando un emocitometro e una colorazione blu di Trypan.
Dopo il conteggio, aggiungere il numero desiderato di cellule T al mezzo e capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Piastra 2,5 millilitri di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 gradi Celsius in anidride carbonica umidificata al 5%.
Esaminare le cellule T sotto un obiettivo 20X ogni giorno per tre giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Successivamente, per preparare una piastra RetroNectin, aggiungere due millilitri di 20 microgrammi per millilitro di RetroNectin in PBS a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti non trattata e incubare per due ore a temperatura ambiente. Aspirare il RetroNectin senza graffiare il fondo della piastra e aggiungere tre millilitri di 2% BSA in PBS per pozzetto nella piastra a sei pozzetti.
Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, per la spinoculazione, aspirare la BSA e lavare i pozzetti una volta con tre millilitri di PBS. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di supernatante virale CBRTDR luciferasi per pozzetto e centrifugare a 1.240 G per 90 minuti a 32 gradi Celsius. Per la trasduzione, dopo aver contato le cellule T, aspirare il surnatante virale e placcare due milioni di cellule T per pozzetto in sei millilitri di DMEM contenente 30 unità internazionali per millilitro di IL-2 umano. Esaminare le cellule T per due giorni.
Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere nove millilitri di supporto per un volume totale di 15 millilitri per pallone. Il giorno successivo, aggiungere 15 millilitri di mezzi e confermare la trasduzione corretta eseguendo la citometria a flusso.
Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzando un ago calibro 26, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 microlitri di terreno retroorbitalmente. Somministrare 1.000 unità di IL-2 ricombinante per via sottocutanea per supportare la sopravvivenza delle cellule T in vivo. Quindi somministrare l'anticorpo bispecifico retroorbitalmente o intraperitonealmente.
Per l'imaging in vivo, somministrare 100 microlitri di tre milligrammi di D-luciferina mediante iniezione retroorbitale con un ago calibro 26 in un topo anestetizzato. Per acquisire immagini, posizionare il mouse nella camera a tenuta di luce dell'imager in modo che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Utilizzando il pannello di controllo dell'acquisizione, selezionare luminescente, fotografia e sovrapposizione.
Imposta il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e f-stop su uno e acquisisci immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Prendi un'altra serie di immagini con il topo supino per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.
Le cellule T armate trafficavano verso il tumore più velocemente delle cellule T disarmate, lasciando i polmoni due giorni prima. La quantificazione dell'infiltrazione delle cellule T nei tumori nel tempo è stata misurata mediante bioluminescenza ed espressa come stormi totali o radianza per pixel integrato sul contorno tumorale. Il traffico delle cellule T potrebbe essere monitorato per 28 giorni dopo l'iniezione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi, consentendo di tracciare l'homing e la persistenza delle cellule T durante il trattamento.
Viene mostrato il traffico di cellule T in xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario umano HER2 positivo in topi DKO. Il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 con FC non silenziata non ha avuto alcun effetto sulla crescita tumorale rispetto a un anticorpo bispecifico controllato. Al contrario, il trattamento con l'anticorpo bispecifico HER2 contenente la mutazione N297A da solo o in combinazione con una mutazione K322A è stato in grado di arrestare completamente la crescita tumorale.
Per i gruppi con mutazioni silenzianti, il segnale di luminescenza delle cellule T ha raggiunto un picco più elevato il terzo giorno dopo l'iniezione e persisteva a un livello più elevato rispetto all'anticorpo bispecifico controllato e all'anticorpo bispecifico HER2 non silenziato. I topi portatori di xenotrapianti derivati da pazienti affetti da neuroblastoma hanno dimostrato che la deplezione dei macrofagi positivi a Ly6C ha aumentato significativamente l'homing delle cellule T nei tumori, con conseguente diminuzione della crescita tumorale e sopravvivenza prolungata. L'effetto era più pronunciato negli xenotrapianti derivati da pazienti affetti da osteosarcoma.
Tra gli anticorpi bispecifici mirati all'antigene tumorale STEAP1, il formato IGGL SCFV ha determinato un'infiltrazione di cellule T significativamente maggiore il sesto giorno dopo la prima dose di cellule T che è persistita per tutta la durata del trattamento. Tali osservazioni non sono state previste da saggi di citotossicità in vitro. Dopo aver monitorato le cellule T in vivo, gli utenti possono ancora eseguire l'immunoistochimica per determinare più specificamente dove si trovano le cellule T all'interno del tumore o di altri tessuti normali.
