Ad oggi non esiste una piattaforma di imaging delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico clinicamente convalidata. Il symporter sodio-ioduro rappresenta un reporter sensibile e clinicamente rilevante per l'immagine delle cellule T car mediante scansione PET. L'imaging PET TLP delle cellule T CAR NIS consente agli investigatori di tracciare in modo non invasivo le cellule infuse in vivo e ha un potenziale per prevedere l'efficacia e la tossicità della terapia con cellule T CAR.
L'imaging efficiente delle cellule T CAR consente la valutazione del traffico e dell'espansione delle cellule T e consente lo sviluppo di strategie per superare i limiti. I metodi descritti in questo protocollo sono semplici e possono essere applicati ad altri costrutti CAR oltre a quelli mostrati in questo studio. Inizia con l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico o PBMC dal campione di sangue utilizzando la tecnica del gradiente di densità standard.
Per fare ciò, aggiungere delicatamente 15 millilitri di gradiente di densità medio a un tubo di separazione con gradiente di densità di 50 millilitri evitando la formazione di bolle. Per evitare l'intrappolamento cellulare, diluire il campione di sangue con PBS contenente il 2% di FBS con un rapporto di volume uno a uno e trasferire delicatamente il sangue diluito sulla parte superiore del mezzo gradiente di densità senza rompere l'interfaccia tra i due. Quindi centrifugare il tubo di separazione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Raccogliere il surnatante in un tubo conico fresco da 50 millilitri, lavare le celle con PBS contenente il 2% di FBS riempiendo il tubo fino a 50 millilitri e centrifugando il tubo a 300 volte G per otto minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante prima di risospendere le celle pellettate in 50 millilitri di PBS contenenti il 2% di FBS. Risospesso i PBMC pellettizzati in PBS contenenti il 2% di FBS ad una concentrazione di 50 volte 10 alla sesta cella per millilitro.
Ripetere il lavaggio in un tubo fresco da 50 millilitri. Contare il numero di celle e quindi centrifugare la sospensione cellulare a 300 volte G per otto minuti a temperatura ambiente. Per l'isolamento delle cellule T, trasferire PBMC isolati in un tubo di fondo rotondo in polistirene da 14 millilitri.
Quindi utilizzare un kit di perline magnetiche di selezione negativa per eseguire l'isolamento delle cellule T posizionando i PBMC in un cocktail di anticorpi di selezione negativa in un separatore cellulare completamente automatizzato. Dopo l'isolamento delle cellule T, contare le cellule e coltivare le cellule nel mezzo di espansione delle cellule T o TCM ad una concentrazione di due volte 10 alla sesta cellula per millilitro. Quindi, mescolare il flaconcino contenente le perle anti-CD3/CD28 ruotando e pipettando il volume richiesto di perline in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri.
Per il lavaggio, risospesciare le perline in un millilitro di MTC prima di posizionare il tubo su un magnete per un minuto e aspirare il surnatante. Dopo aver rimosso il tubo dal magnete, risospesciare le perline lavate in un millilitro di MTC e ripetere il lavaggio due volte. Sospendere le perle lavate in un millilitro di MTC per trasferirle alla coltura delle cellule T, quindi diluire la sospensione di perline di cellule T con MTC a una concentrazione di 1,0 volte 10 alla sesta cellula per millilitro prima di trasferirla in una coltura tissutale trattata con piastra a sei pozzetti.
Incubare la piastra del pozzo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per progredire con la trasduzione dei lentivirus, scongelare i lentivirus congelati nel rivestimento dei recettori dell'antigene chimerico o del symporter dello ioduro di sodio a quattro gradi Celsius. Dopo 24-48 ore di stimolazione delle cellule T, mescolare le cellule T per rompere i cluster e aggiungere il lentivirus appena scongelato alle cellule a una molteplicità di infezione di cinque.
Incubare le cellule T trasdotte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Nei giorni tre, quattro e cinque di incubazione, contare le cellule T trasdotte e regolare la concentrazione cellulare a 1,0 volte 10 alla sesta cella per millilitro aggiungendo TCM preriscaldata fresca. Per le cellule T trasdotte NIS che trasportano il gene di resistenza alla puromicina, trattare le cellule con un microgrammo per millilitro di puromicina dicloridrato nei giorni tre, quattro e cinque.
Il sesto giorno, rompere i cluster di cellule T e rimuovere le perle anti-CD3 / CD28 dalle cellule T trasdotte posizionando la piastra su un magnete per un minuto. Quindi riposizionare le cellule raccolte nella coltura ad una concentrazione di 1,0 volte 10 alla sesta cella per millilitro. Lavare un'aliquota della coltura di cellule T contenente 50.000 cellule con buffer di flusso e risospese le celle con 50 microlitri di buffer di flusso.
Per rilevare l'espressione di CAR, colorare le cellule T con un microlitro di anticorpo anti-topo di capra. Per escludere le cellule morte, aggiungere 0,3 microlitri di LIVE/DEAD Aqua. Incubare le cellule macchiate al buio a temperatura ambiente.
Dopo 15 minuti, lavare le celle con 150 microlitri di tampone di flusso a 650 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Per fissare e permeabilizzare le cellule colorate, incubare le cellule con 100 microlitri di mezzo di fissazione per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule due volte con 100 microlitri di un tampone contenente un agente permeabilizzante cellulare come saponina e centrifuga.
Dopo il lavaggio, risospese le cellule permeabilizzate in 50 microlitri di un tampone permeabilizzante. Quindi aggiungere 0,3 nanogrammi di anticorpo ETNL NIS anti-umano e incubare a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora di incubazione, lavare le cellule aggiungendo 150 microlitri di tampone di flusso e centrifuga come dimostrato.
Quindi incubare le cellule con 50 microlitri di tampone di flusso contenenti 2,5 microlitri di anticorpo secondario anti-coniglio per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule T come dimostrato, risospese le cellule in 200 microlitri di tampone di flusso per eseguire la citometria a flusso. Quindi determinare l'efficienza di trasduzione delle cellule.
L'ottavo giorno, contare e far girare le cellule T a 300 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius prima di risospendere il pellet cellulare con un mezzo di congelamento ad una concentrazione di 10 volte 10 alla sesta cella per millilitro. Trasferire un millilitro della sospensione cellulare in ogni flaconcino criomarchia etichettato per conservare a meno 80 gradi Celsius congelatore per 48 ore. Dopo 48 ore, trasferire le cellule T in azoto liquido.
Preparare i topi iniettati con cellule T BCMA CAR NIS positive per l'imaging PET / CT pesando i topi e rimuovendo i marchi auricolari metallici. Quindi iniettare 9,25 megabecquerel di tetrafluoroborato F18 appena preparato nel topo per via endovenosa tramite iniezione della vena della coda. Dopo 45 minuti di periodo di assorbimento, procedere all'acquisizione di immagini PET statiche di un mouse anestetizzato per 15 minuti, seguite dall'acquisizione di immagini CT per cinque minuti con rotazione a 360 gradi e 180 proiezioni.
In questa analisi rappresentativa, la co-trasduzione di due virus in cellule T ha generato cellule T BCMA CAR NIS positive in cui oltre il 90% delle cellule era NIS positivo. L'analisi della cinetica di crescita delle cellule T da zero a otto giorni ha rivelato che l'incorporazione di BCMA CAR e NIS non ha avuto un impatto significativo sull'espansione delle cellule T rispetto alle cellule non trasdotte. Nell'analisi citometrica a flusso di OPM-2, le cellule trasdotte con lentivirus rappresentavano l'espressione di GFP dopo il trattamento con puromicina.
I topi che hanno ricevuto cellule OPM-2 BCMA positive alla luciferasi positiva sono stati sottoposti a imaging a bioluminescenza per confermare l'attecchimento delle cellule OPM-2. L'imaging PET del topo somministrato con tetrafluoroborato F18 ha rivelato la distribuzione delle cellule T BCMA CAR positiva al NIS nei vari organi e midollo osseo. Inoltre, le cellule del midollo osseo raccolte dal topo mostravano l'attecchimento delle cellule OPM-2 e la consegna delle cellule T BCMA CAR NIS positive al midollo osseo.
Per l'imaging di alta qualità delle cellule T CAR infuse, è importante seguire le fasi del protocollo di generazione delle cellule T NIS CAR e confermare la presenza di frazioni NIS e CAR positive doppie.
