Il nostro protocollo descrive un sistema affidabile per misurare la contrattilità nei cardiomiociti primari umani adulti. Il nostro sistema è un metodo di registrazione ottica non invasivo a medio rendimento che misura continuamente la contrattilità di più cellule in parallelo e consente il monitoraggio in tempo reale degli effetti dei farmaci. I nostri metodi supportano la scoperta di nuove molecole con il profilo più desiderato per la correzione dello scompenso cardiaco.
Fornisce inoltre un approccio preclinico per la previsione dei rischi di contrattilità indotta da farmaci. Per iniziare, posizionare un singolo vetrino coprioggetto in ogni pozzetto di una piastra di coltura a otto pozzetti. Preparare cinque microgrammi per millilitro di laminina aggiungendo 800 microlitri di laminina 521 ricombinante umana a 7,2 millilitri di soluzione B e mescolare bene.
Aggiungere 200 microlitri della soluzione di laminina diluita al centro del vetrino coprioggetto. Coprite il piatto e impilatelo in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Diluire dimetilsolfossido o DMSO 1000 volte in soluzione C per ottenere una soluzione veicolo allo 0,1% di DMSO.
Per testare il composto a una, 10, 100 e 1000 volte la sua esposizione terapeutica di 0,001 micromolari, sciogliere il composto in DMSO a una concentrazione di un millimolare. Diluire la soluzione del composto di prova DMSO in serie con DMSO per produrre altri tre stock. Infine, diluire ogni composto in esame vecchio di 1000 in 50 millilitri di soluzione C per ottenere le concentrazioni finali del test.
Aggiungere la soluzione veicolare e le soluzioni delle concentrazioni micromolari finali del composto a siringhe da 50 millilitri. Collegare le siringhe al sistema di flusso a gravità, quindi adescare il sistema di flusso a gravità. Rimuovere dal frigorifero una piastra a otto pozzetti contenente un vetrino coprioggetto rivestito in laminato e collocarlo in una camera di registrazione pulita.
Rimettere il piatto in frigorifero fino alla successiva impiattamento. Aspirare la soluzione B dal flaconcino intensificato per raggiungere il volume più piccolo senza perdere cellule. Quindi erogare 200 microlitri di soluzione cellulare nella camera del microscopio di registrazione montata sul tavolino di un microscopio invertito e lasciare che le cellule si depositino sul vetrino coprioggetto per cinque minuti.
Successivamente, aprire il campo visivo sul microscopio e determinare se la densità cellulare è adeguata per l'inizio dell'esperimento. Una volta terminata la placcatura, equilibrare le celle per cinque minuti perfondendole continuamente con la soluzione C utilizzando il sistema di perfusione a flusso gravitazionale. Regolare correttamente l'aspirazione, accendere la scatola di controllo della temperatura e una piastra riscaldante e impostarli per fornire 35 gradi Celsius.
Quindi su uno stimolatore di campo con una coppia di fili di platino posti sui lati opposti della camera, stimolare le cellule con una tensione di sovrasoglia a una frequenza di stimolazione di un hertz. Impostare l'ampiezza dell'impulso stimolante a un volt e aumentarla fino a quando i cardiomiociti iniziano a generare cicli di contrazione-rilassamento. Seleziona le cellule sane con morfologia a forma di bastoncino e striature chiare, quindi regola il campo visivo e concentrati sul portare in vista il maggior numero possibile di cellule in contrazione.
Successivamente, sono state visualizzate le immagini digitalizzate delle cellule all'interno del software di acquisizione del sistema di registrazione della contrattilità ottica. Quando si seleziona l'area di interesse o il ROI, evitare le aree fuori fuoco e le aree vicine al bordo delle celle. Avviare l'esperimento per valutare gli effetti del composto.
Il software di acquisizione gestirà l'acquisizione dei dati. Visualizzazione ed etichettatura automatica delle concentrazioni di prova e del tempo di trattamento. Applicare le concentrazioni di prova se la contrazione rimane a un'ampiezza stabile per l'intero periodo di riferimento del veicolo.
Escludere le celle che visualizzano una rincorsa o una discesa. Esegui l'analisi offline utilizzando il software di analisi e una macro personalizzata per calcolare la media dei dati. Il software calcola e riporta varie metriche dai dati di dinamica del sarcomero prodotti dal software di acquisizione.
Quantificare gli effetti del composto in esame sull'ampiezza media della contrattilità rispetto alla specifica condizione di controllo del veicolo al basale di ciascun cardiomiocita. Esprimere i risultati medi come media più/meno SEM e produrre un grafico che traccia l'effetto di concentrazione del composto in esame sull'ampiezza della contrattilità. Quindi adattare la curva concentrazione-risposta all'equazione di collina per derivare i valori IC50 e EC50.
Successivamente, identificare la postcontrazione come una contrazione secondaria spontanea transitoria del cardiomiocita che si verifica prima della successiva contrazione regolare e produce una contrazione anomala e non sincronizzata. Identificare il fallimento della contrazione come l'incapacità dello stimolo elettrico di indurre una contrazione. Visualizza la variabilità a breve termine, o STV, e le alternative nei diagrammi di Poincaré della variabilità dell'ampiezza della contrazione.
Calcolare l'STV con gli ultimi 20 transitori di ciascun periodo di concentrazione dell'articolo di controllo e dell'articolo di prova. Quindi identifica gli alternani come ripetitivi, alternando transienti di ampiezza di contrattilità brevi e lunghi. Per calcolare l'incidenza della pro-aritmia, normalizzare i valori di STV al valore di controllo del veicolo di ciascuna cellula, tracciare la post-contrazione, il fallimento della contrazione, l'STV e le alternanze ed esprimerli come percentuale dell'incidenza delle cellule che presentano ciascuno dei segnali.
Completa la profilazione meccanicistica multiparametrica con il calcolo del tempo al picco, del decadimento al 30% e poi del 90% di rilassamento, del tempo al 90% di rilassamento, della lunghezza del sarcomero di base, del tempo al 50% del picco, dell'altezza del picco, della lunghezza del sarcomero alla contrattilità del picco, della velocità massima di contrazione e della velocità massima di rilassamento. Quindi esprimi questi parametri relativi alla specifica condizione di controllo basale di ciascun cardiomiocita e li rappresentiamo graficamente in grafici di concentrazione-risposta. Questo studio mostra la convalida della misurazione della contrattilità dei cardiomiociti umani e l'effetto della stimolazione beta-adrenergica.
Non ci sono stati transienti di contrattilità spontanei nei cardiomiociti umani e i cardiomiociti rispondono alla stimolazione elettrica esterna con cicli di contrattilità-rilassamento, così come all'isoproterenolo, un agonista beta-adrenergico. L'isoproterenolo produce un aumento della contrattilità dipendente dalla concentrazione e sono stati caratterizzati anche i suoi effetti sulla cinetica del transiente di contrattilità. Dopo la misurazione della contrattilità, possiamo eseguire la misurazione del transitorio di calcio con un indicatore fluorescente.
Tali dati aiutano a determinare se il cambiamento nella contrattilità richiede un cambiamento nella dinamica del calcio. Il nostro metodo apre la strada ai ricercatori cardiaci per sviluppare una migliore comprensione della fisiologia e della farmacologia dei cardiomiociti umani, stabilire la struttura, l'attività e le relazioni di nuovi farmaci ed esplorare il loro meccanismo d'azione.
