Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e difficili da propagare. Le poche linee cellulari stabilite non sono prontamente disponibili per i ricercatori. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato questo protocollo di cultura 3D.
Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D possono essere ottenute e il test dei farmaci può essere fatto entro tre settimane. Questo metodo può essere applicato ad altri tumori neuroendocrini come i tumori neuroendocrini del pancreas. Dopo aver ottenuto un campione SBNET del paziente risigillato, tagliarlo a cubetti di cinque millimetri e conservarlo in 25 millilitri di mezzo DMEM F12 in un tubo conico per il trasporto.
Incubare i tumori nel mezzo di lavaggio preparato secondo le indicazioni manoscritte per 15 minuti. Quindi trasferirli su un nuovo piatto e tritarli in pezzi di meno di un millimetro usando forbici curve sterili. Trasferire i tessuti tritati in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di mezzo di lavaggio, quindi centrifugare il campione a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di mezzo di lavaggio con collagenasi e DNasi. Lasciare digerire i tumori tritati a 37 gradi Celsius con scuotimento lento per 90 minuti. È importante non digerire e più volte i campioni di tumore.
Troppi enzimi o tempi di incubazione più lunghi uccideranno le cellule SBNET. Al termine della digestione, centrifugare il tubo a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 15 millilitri di mezzo di lavaggio.
Posizionare un colino a celle di 70 micrometri sopra un nuovo tubo da 50 millilitri e trasferire 10 millilitri del tampone di lavaggio attraverso il filtro. Ruotare il tampone di lavaggio all'interno del tubo per evitare che le cellule si attacchino ai lati. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso il filtro.
Centrifugare le cellule a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di mezzo di lavaggio. Posizionare il tubo sul ghiaccio e utilizzare cinque microlitri delle cellule per il conteggio delle cellule con un emocitometro.
Calcolare il numero di cellule, quindi ripetere la centrifugazione per rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in ECM liquido ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Successivamente, trasferire da cinque a 20 microlitri di sferoidi SBNET in ECM su una piastra di pozzo da 96 e posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius per consentire all'ECM liquido di solidificarsi. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura SBNET a ciascun pozzo contenente sferoidi o coltura gli organoidi nei mezzi delle cellule staminali come descritto in precedenza.
Utilizzare una pipetta P1000 per trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo a 1.500 volte g per un minuto per rimuovere il supernatante. Lavare la coltura con un millilitro di PBS e centrifugare di nuovo per rimuovere il supernatante. Quindi fissare gli organoidi aggiungendo 500 microlitri di paraformaldeide e incubandoli per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare la coltura due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di PBS con 3%BSA e 0,1%Triton X-100 per permeabilizzare la coltura. Incubare il tubo per cinque minuti, quindi lavare gli organoidi tre volte con un millilitro di PBS e 3%BSA.
Successivamente, incubare la coltura con anticorpi primari per un'ora, quindi ripetere i lavaggi con PBS e BSA. Incubare con gli anticorpi secondari e ripetere i lavaggi assicurandosi di aspirare e scartare tutti i supernatanti. Per immaginire gli sferoidi, aggiungere cinque microlitri di supporto contenente DAPI e utilizzare una pipetta P20 per trasferire cinque microlitri degli sferoidi in uno scivolo di vetro.
Sigillare lo scivolo con un coverslip e un'immagine con un microscopio a fluorescenza utilizzando gli obiettivi 10, 20 e 40X. Rompere meccanicamente l'ECM con una pipetta P1000 e trasferirlo in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 1.000 volte g a quattro gradi Celsius.
Quindi rimuovere tutti i supernatanti e posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere da due a quattro volte il volume del nuovo ECM al pellet e mescolare il contenuto del tubo tubazione su e giù 10 volte assicurandosi di evitare l'introduzione di bolle d'aria. Trasferire da cinque a 20 microlitri della miscela ECM e SBNET su una nuova piastra da 96 pozza e consentire all'ECM di solidificarsi.
Quindi coprire l'ECM solidificato con il nuovo mezzo SBNET e mettere la piastra nell'incubatore. Se si spedono sferoidi SBNET in un altro laboratorio, trasferire gli sferoidi con il nuovo ECM in un pallone T25 e consentire all'ECM di solidificarsi. Riempire il pallone con mezzo sferoide SBNET, avvitare saldamente il cappuccio e preparare il pacco di spedizione.
Dopo aver ricevuto la cultura dello sferoide, rimuovere il mezzo di coltura e ripetere i passaggi precedenti per rimettere gli sferoidi in cultura. Il tasso di crescita dello sferoide SBNET è stato monitorato con immagini microscopiche. Ci vogliono circa 14 giorni perché gli sferoidi SBNET raddoppino quando i supporti di coltura vengono cambiati una volta alla settimana.
Dopo 14 giorni di coltura, gli sferoidi SBNET non aumentano di dimensioni. Gli sferoidi sono stati macchiati con anticorpi specifici contro la sinaptofisina, la cromogranina A e lo SSTR2 e sono stati con immagini utilizzando la microscopia ad immunofluorescenza. I dati hanno mostrato che questi marcatori sono localizzati nel citoplasma e nella membrana delle cellule SBNET.
Per garantire la specificità degli anticorpi, le stesse procedure di colorazione sono state eseguite su una linea organoide da un tumore del pancreas che non esprime sinaptofisina, cromogranina A e SSTR2 e non è stato rilevato alcun segnale verde. Il vantaggio principale dell'imaging ad immunofluorescenza è che può essere eseguito entro quattro ore e fornire informazioni di colorazione simili a quella dell'immunoistochimica. Coltivare SBNET come sferoidi è una tecnica preziosa per identificare i farmaci che possono inibire la crescita di SBNET.
Gli sferoidi sono stati trattati con rapamicina e inibitore del mTOR. Dopo cinque giorni, lo sferoide trattato con rapamicina formò una struttura simile all'uva e divenne apoptotico o necrotico. Quando si tenta questa procedura, è importante pre-bagnare il filtro cellulare e il tubo di raccolta con mezzo di lavaggio.
Ciò impedirà alle cellule SBNET di attaccarsi al filtro cellulare e al tubo di plastica. Con questo protocollo, scienziati e clinici possono stabilire colture sferoidi SBNET da tumori resected, condividerli con altri laboratori e usarli per testare i farmaci approvati dalla FDA.
