Questo protocollo mostra una guida passo-passo per misurare la rigidità di idrogel e cellule utilizzando un nanopenetratore disponibile in commercio e presenta anche un software open source per analizzare in modo riproducibile i dati acquisiti. Il protocollo ci consente di ottenere dati simili alla microscopia a forza atomica, tuttavia, a una frazione della complessità. Quindi questo protocollo sarà utile per gli scienziati interessati a studiare le proprietà meccaniche di campioni sani e malati, ma crediamo anche che sarà di più ampia applicabilità nel contesto della nanoindentazione per materiali morbidi.
Dopo aver acceso lo strumento e montato la sonda selezionata per l'esperimento, iniziare a calibrare la sonda. Fare clic su Inizializza nella finestra principale del software. Nel menu di calibrazione visualizzato, immettere i dettagli della sonda nelle caselle di input.
Quindi, riempire una spessa capsula di Petri di vetro con un fondo piatto con lo stesso mezzo del piatto campione e abbinare la temperatura del mezzo con quella del campione. Quindi, posizionare il piatto di calibrazione sotto la sonda. Per la calibrazione in liquido, pre-bagnare la sonda con una goccia di etanolo o isopropanolo al 70% con l'estremità della pipetta a contatto leggero con la ghiera di vetro, in modo tale che la goccia scivoli sul cantilever e sulla punta sferica.
Quindi, far scorrere manualmente il braccio del nanopenetratore verso il basso fino a quando la sonda è completamente sommersa ma ancora lontana dal fondo della capsula di Petri. Attendere cinque minuti per consentire il raggiungimento delle condizioni di equilibrio nel liquido. Successivamente, nel menu Inizializza del software, fare clic su Scan Wavelength.
Lo schermo dell'interferometro mostrerà una barra di avanzamento. Verificare se la scansione ottica ha avuto esito positivo accedendo al pannello Scansione lunghezza d'onda sulla casella dell'interferometro. Quindi, nel menu Inizializza, fare clic su Trova superficie per abbassare progressivamente la sonda.
La sonda smette di muoversi quando entra in contatto con la capsula di Petri di vetro. Una volta che la sonda è a contatto con la superficie, spostare la sonda verso il basso di un micrometro utilizzando il pulsante freccia y verso il basso nella finestra principale del software. Osservare il segnale verde nella finestra live per i cambiamenti nella linea di base con ogni passo di un micrometro.
Quindi, fare clic su Calibra dal menu Inizializza. Al termine della calibrazione, controllare i fattori di calibrazione vecchi e nuovi nella finestra popup visualizzata. Se il nuovo fattore di calibrazione è nell'intervallo corretto, come spiegato nel manoscritto, fare clic su Usa nuovo fattore.
Quindi, spostati verso l'alto del piezo di 500 micrometri. Quindi, verificare se il cerchio di demodulazione è stato calibrato correttamente accedendo alla scheda Demodulazione sul desktop dell'interferometro. Picchiettare delicatamente sul tavolo ottico o sul nanopenetratore per indurre abbastanza rumore.
Un cerchio bianco di punti dati discreti dovrebbe coprire approssimativamente il cerchio rosso. Caricare la capsula di Petri contenente il campione sullo stadio del microscopio e spostare manualmente la sonda del nanopenetratore nella posizione desiderata sopra il campione. Far scorrere la sonda in soluzione, avendo cura di lasciare da uno a due millimetri tra la sonda e la superficie del campione.
Attendere cinque minuti affinché la sonda si bilanci in soluzione. Concentrarsi sulla sonda con il microscopio ottico. Per misurare il modulo di materiali morbidi di Young, fare clic su Configura esperimento.
Aggiungete un passo Trova superficie e un singolo rientro nel controllo dello spostamento per determinare i parametri sperimentali da utilizzare successivamente per la scansione automatica della matrice. Se il singolo rientro ha esito positivo, configurare una scansione a matrice contenente da 50 a 100 punti distanziati da 10 a 100 micrometri. Dopo aver verificato che la casella Trova automaticamente superficie sia selezionata, fare clic su Usa posizione stage per avviare la scansione della matrice dalla posizione dello stage corrente.
Impostare il profilo di scansione della matrice nel controllo dello spostamento. Lasciate il numero di segmenti a cinque e utilizzate il profilo di spostamento di default. Se necessario, modificare il profilo di spostamento e il tempo per ciascun segmento inclinato.
Non superare velocità di deformazione superiori a 10 micrometri al secondo. Salvare l'esperimento configurato nel percorso dell'esperimento desiderato. Fai clic su Esegui esperimento e attendi che sia completato.
Una volta acquisiti tutti i dati, pulire la sonda e spegnere lo strumento come descritto nel testo. Per lo screening delle curve di forza-spostamento e la produzione di set di dati puliti in formato JSON, preparare il lancio. py dalla riga di comando sul computer lab.
Selezionare il formato dati Optics11 dall'elenco a discesa. Se i dati non vengono caricati correttamente, riavviare l'interfaccia utente grafica e selezionare Optics11 Old. Quindi, fai clic su Carica cartella e seleziona una cartella contenente i dati da analizzare.
Pulire il set di dati utilizzando le schede presenti sulla destra dell'interfaccia utente grafica. Quindi, fai clic su Salva JSON e inserisci un nome appropriato per il set di dati pulito. Inviare il file JSON al computer in cui è stato installato il software NanoAnalysis, se diverso dal computer corrente.
Avvia il nano. py dalla riga di comando. In alto a sinistra dell'interfaccia utente grafica, fai clic su Load Experiment e seleziona il file JSON.
Questo popolerà l'elenco dei file e il grafico delle curve grezze che mostra il set di dati in termini di curve di forza-spostamento. Nella casella Statistiche selezionare i valori dei tre parametri, N attivato, N non riuscito e N escluso. Per visualizzare una curva specifica in modo più dettagliato, fare clic sulla curva.
Questo lo evidenzierà in verde e lo mostrerà sul grafico della curva corrente. Una volta selezionata una singola curva, i parametri R e k verranno popolati nella casella Statistiche. Una volta che il set di dati è stato ulteriormente pulito, filtrare qualsiasi rumore nelle curve utilizzando i filtri implementati nella casella Filtro.
Quindi, esaminate le curve filtrate nel grafico della curva corrente. La curva filtrata è in nero, mentre la versione non filtrata è verde. Per trovare il punto di contatto, dalla casella Punto di contatto, scegliere una di una serie di procedure numeriche che sono state implementate nel software.
Regolare i parametri dell'algoritmo in base al set di dati in modo che il punto di contatto sia posizionato correttamente, come spiegato nel manoscritto. Per visualizzare dove è stato trovato il punto di contatto su una singola curva, selezionare la curva facendo clic su di essa. Quindi, fare clic su Ispeziona.
Controlla la finestra popup visualizzata per identificare dove si trova il punto di contatto. Quindi, fai clic su Analisi Hertz. Questo genererà tre grafici.
Controllare i dati di rientro della forza per ogni curva nel set di dati, insieme all'adattamento medio di Hertz mostrato in rosso. Quindi, controlla la curva di rientro della forza media con una banda di errore che mostra una deviazione standard, insieme all'adattamento medio di Hertz mostrato in rosso. Quindi, controlla il grafico a dispersione del modulo di Young originato dall'adattamento del modello di Hertz a ogni singola curva.
Ispezionare la casella Risultati per il modulo di Young medio calcolato e la sua deviazione standard e assicurarsi che siano ragionevoli per l'esperimento dato. Quindi, nella casella Salva, fai clic su Hertz. Nella finestra popup, inserisci il nome e la directory del file e fai clic su Salva.
Verrà creato un file tsv. Apri il file tsv in qualsiasi software aggiuntivo per l'analisi statistica e l'ulteriore tracciatura. Per i dati di nanoindentazione cellulare, fare clic su Analisi spettri di elasticità.
Ispezionare i due grafici prodotti, vale a dire il modulo di Young in funzione della profondità di indentazione per ogni curva e il modulo medio di Young in funzione dell'indentazione montato da un modello a doppio strato. Una volta terminata l'analisi, fare clic su ES nella casella Salva. Questo esporterà un file tsv nella directory specificata, che può essere aperto e tracciato in qualsiasi altro software di scelta.
Un esperimento di successo si traduce nel segmento di avvicinamento di una curva di spostamento della forza, con una linea di base chiara e piatta, una regione di transizione e una regione inclinata. Le curve che mostrano alterazioni da questa forma vengono facilmente rimosse dal set di dati utilizzando NanoPrepare. Qui sono mostrate le curve medie di forza-indentazione insieme al modello Hertz medio per un idrogel di poliacrilammide morbido e un idrogel rigido.
Tracciando i singoli valori del modulo di Young, è stato recuperato il modulo medio di Young atteso per entrambi gli idrogel. Per gli esperimenti di nanoindentazione cellulare, la curva media forza-indentazione e il corrispondente modello di Hertz medio dimostrano che il modello di Hertz non cattura completamente l'evoluzione della forza con l'aumentare della profondità di indentazione per gli esperimenti di nanoindentazione cellulare. Gli spettri di elasticità media adattati fino a una rientranza di 200 nanometri sono qui dimostrati.
Gli spettri di elasticità media iniziano ad aumentare ad una profondità di indentazione di 200 nanometri, indicando il contributo di un substrato al modulo di Young apparente sondato. Per questo motivo, 200 nanometri è stato scelto come gamma di adattamento sia per il modello Hertz che per il modello a doppio strato. L'adattamento del modello a doppio strato consente di estrarre maggiori informazioni sullo stato meccanico della cellula, incluso lo spessore della corteccia di actina cellulare, il modulo della corteccia di actina cellulare e il modulo di massa cellulare, come spiegato nel testo principale.
Un confronto diretto tra il modello di Hertz e l'approccio degli spettri di elasticità in termini di distribuzione del modulo di Young rivela distribuzioni sovrapposte con mezzi comparabili, dimostrando la fattibilità dell'approccio degli spettri di elasticità. Individuare con precisione il punto di contatto e mantenere i parametri dell'algoritmo scelti coerenti tra i set di dati che si desidera confrontare è fondamentale per ottenere confronti affidabili tra i campioni. Il metodo è di applicabilità generale per quantificare le proprietà elastiche locali di campioni biologici, inclusi sferoidi, organoidi, tessuti e in generale tutta la materia soffice.
