L'isolamento di plastoglobuli altamente puri è fondamentale per il loro studio. Un protocollo rapido ed efficace per il loro isolamento che facilita la loro indagine biochimica a valle è presentato qui. Il vantaggio principale di questo metodo è la relativa velocità di procedura e la sua adattabilità a numerose specie vegetali e condizioni ambientali.
Particolare attenzione deve essere prestata durante la sonicazione delle risospensioni tilacoidi per garantire una forza sufficiente a rimuovere i plastoglobuli dai tilacoidi e con successiva estrazione di plastoglobuli dal gradiente di saccarosio. A dimostrare questa procedura saranno il Dr.Elsinraju Devadasu, un ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio, e Febri Susanto, uno studente di dottorato nel mio laboratorio. Inizia acquistando piantine di tre settimane di sei mais sano, con stadio di crescita V5 e del peso di circa 120 grammi.
Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo e immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio prima di trasportarle nella cella frigorifera. Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e tagliarle in pezzi più piccoli di cinque centimetri per cinque usando le forbici. Macinare delicatamente e accuratamente metà del tessuto fogliare tagliato in 350 millilitri del tampone di macinazione a un livello inferiore a sette su un frullatore commerciale.
Avviare e arrestare il frullatore da cinque a sei volte per assicurarsi che tutte le foglie siano tagliate. Filtrare l'omogenato attraverso uno strato di panno di nylon da 25 micron su un grande imbuto fino a quattro bottiglie di centrifuga da 250 millilitri. Dopo aver ripetuto la fase di miscelazione con il tessuto fogliare tagliato rimanente, dividere uniformemente il filtrato tra le quattro bottiglie.
Prelevare un'aliquota del filtrato fogliare e metterlo da parte per essere conservato come campione rappresentativo totale di foglie. Quindi, centrifugare il filtrato per sei minuti a 1.840 G e quattro gradi Celsius. Versare il surnatante risultante e, con delicati movimenti vorticosi del pennello, risospendere il pellet in 12 millilitri di R 0,2 medio, contenente 0,2 molari di saccarosio.
Dopo aver risospeso il pellet in una bottiglia, aggiungere la sospensione alla bottiglia successiva e ripetere la risospensione per raggruppare le sospensioni in una bottiglia. Distribuire la sospensione in pool tra sei tubi ultracentrifuga da tre millilitri, raggiungendo un volume massimo di 2,5 millilitri in ciascun tubo. Quindi utilizzare il sonicatore di punta ad un'ampiezza del 100% per sonicare ogni tubo quattro volte per 10 secondi ciascuno.
Assicurarsi di mantenere il corno del sonicatore immerso e lontano dalla superficie del liquido per evitare schiuma. Muovi lentamente il corno del sonicatore su e giù all'interno della sospensione durante ogni round. Mentre si alternano i quattro tubi, riportare ogni tubo in un secchiello del ghiaccio dopo ogni sonicazione per consentire al campione di raffreddarsi.
Una volta fatto, centrifugare la sospensione tilacoide grezza sonicata a 150.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Scremare la superficie del cuscino usando una siringa e un ago calibro 22 e raccogliere il tampone galleggiante giallo e oleoso risultante di plastoglobuli grezzi dal cuscino di saccarosio. Recuperare circa 500 microlitri da ogni tubo e depositarli in un tubo da 2,0 millilitri.
Raccogliere aliquote tilacoidi grezze prima e dopo la sonicazione e il rilascio di plastoglobuli. Una volta fatto, continuare la lavorazione del tessuto vegetale o conservare i plastoglobuli grezzi a meno 80 gradi Celsius e purificarli in seguito. Coltivare 50 millilitri di coltura PCC 6802 della specie di Synechocystis in terreni BG11 per 7-10 giorni per raggiungere la fase stazionaria.
Utilizzando uno spettrofotometro, regolare la densità della cella a una densità ottica di 2,0 a 750 nanometri. Per rimuovere i polisaccaridi, centrifugare 50 millilitri di coltura e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio delle celle in 50 millilitri di tampone A due volte.
Risospendere il pellet lavato in 25 millilitri di tampone A e rompere le celle utilizzando una cella di pressione francese a 1.100 pollici quadrati di libbra. Ripetere il processo tre volte in condizioni fredde fino a quando il colore lisato cambia da verde a rosso, blu, verde sotto luce bianca. Rimuovere l'aliquota dell'omogenato cellulare e metterla da parte per essere conservata come campione rappresentativo totale di cellule.
Distribuire l'omogenato risultante in otto tubi ultracentrifuga da tre millilitri riempiti fino a un massimo di 2,5 millilitri in ciascun tubo. Sovrapporre questo omogenato con 400 microlitri di R medio, producendo un gradiente di gradini. Bilanciare attentamente i tubi aggiungendo ulteriore mezzo R se necessario prima di centrifugare i tubi.
Il tilacoide e altri organelli più pesanti, compresi i corpi poliidrossialcanoati, mostrano la formazione di pellet, mentre i plastoglobuli formano un cuscinetto oleoso giallo sopra o vicino alla parte superiore del gradiente di saccarosio. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi con una siringa, come dimostrato in precedenza, e depositare il raccolto in un tubo da due millilitri. Raschiare i plastoglobuli dal lato della parete del tubo ultracentrifuga con una punta dell'ago, se necessario.
Continuare con la lavorazione dei cianobatteri o conservare plastoglobuli grezzi a meno 80 gradi Celsius e purificarli in seguito. Per raccogliere i plastoglobuli puri utilizzando il metodo di lavorazione del tessuto vegetale, preparare il gradiente di saccarosio descritto in precedenza utilizzando 500 microlitri di plastoglobuli grezzi, 400 microlitri di R 0,2 medio e 400 microlitri di R. medio. Dopo aver aliquotato i plastoglobuli puri e congelato le aliquote in azoto liquido, conservarle a meno 80 gradi Celsius o liofilizzarle in una polvere secca.
Per raccogliere plastoglobuli puri dai cianobatteri, creare un gradiente di saccarosio, come accennato in precedenza, utilizzando 500 microlitri di plastoglobuli grezzi, 750 microlitri di R 0,7 medio e 750 microlitri di R 0,2 medio. Dopo la centrifugazione, raccogliere i plastoglobuli puri in un tubo da 1,5 millilitri e aliquotare i plastoglobuli puri. Una volta fatto, congelare le aliquote dei plastoglobuli puri in azoto liquido e conservarle direttamente a meno 80 gradi Celsius o liofilizzarle in una polvere secca.
In questo metodo, una quantità significativa di plastoglobulo o materiale di goccioline lipidiche è stata vista galleggiare sullo strato superiore del cuscino di saccarosio. Dopo successiva centrifugazione, sono stati ottenuti plastoglobuli purificati in corrispondenza o vicino alla superficie del gradiente di saccarosio. Dopo il successo dell'isolamento dei plastoglobuli, gli immunoblot sviluppati per la valutazione della purezza utilizzando anticorpi generati contro la fibrillina 1a di arabidopsis thaliana e la subunità D1 del fotosistema di arabidopsis thaliana II hanno mostrato che gli omologhi della fibrillina erano principalmente associati ai tilacoidi rispetto ai plastoglobuli.
Per garantire l'estrazione efficiente e concentrata del tampone galleggiante, posizionare l'orifizio dell'ago della siringa appena sotto la superficie liquida del tampone mentre è completamente immerso, quindi tirare delicatamente verso l'alto. Campioni di plastoglobulo isolati sono suscettibili di successivi studi proteomici o lipidomici e sono stati utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella composizione proteica-lipidica mirata in diverse condizioni ambientali. Questa tecnica ha facilitato nuovi studi sul plastoglobulo, compresa la scoperta dell'attività proteico-chinasica associata e la presenza di complessi proteici oligomerici attraverso successive indagini biochimiche.
