Come per tutti i pazienti affetti da micoplasma, la diagnosi di Mycoplasm pneumoniae è difficile a causa delle reazioni crociate. Il nostro ELISA proposto si basa sulla deplezione selettiva di antigeni non specifici del Mycoplasm pneumoniae utilizzando una tecnica di adsorbimento. L'ELISA di cattura dell'antigene interno descritto in questo video garantisce un'elevata specificità spaziosa.
E in realtà, ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata dell'infezione da Mycoplasm pneumoniae. A dimostrare i passaggi pre-ELISA sarà Imen Chniba, uno studente di dottorato. E le fasi ELISA saranno Nadine Khadraoui, un tecnico del nostro laboratorio.
Per iniziare la procedura di adsorbimento dell'antigene, tirare i 12 antigeni batterici eterologhi in una provetta da microcentrifuga e regolare la concentrazione proteica corrispondente alla metà dell'antisiero da adsorbitare. Quindi, centrifugare la miscela di antigene a 14.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere il pellet. Quindi, risospendere il pellet con il policlonale purificato anti-Mycoplasma pneumoniae IgG e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con lenta agitazione.
Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente la sospensione a 14.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e recuperare il surnatante corrispondente all'antisiero policlonale specifico Mycoplasma pneumoniae. Per rivestire una piastra ELISA a 96 pozzetti con un anticorpo di cattura, diluire l'anticorpo a 10 microgrammi per millilitro e tampone bicarbonato di carbonato 0,1 molare a pH 9,6. Quindi, aggiungere 100 microlitri di anticorpo diluito a ciascun pozzetto della micropiastra e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio. Quindi, bloccare le superfici non legate dei pozzetti rivestiti aggiungendo 100 microlitri della soluzione di blocco a ciascun pozzetto. Dopo aver incubato la piastra da un'ora a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione bloccante con una pipetta e lavare la piastra come dimostrato in precedenza.
Aggiungere una quantità uguale di proteine intere di Mycoplasma pneumoniae ad una concentrazione di 10 nanogrammi per pozzetto e lasciare che la reazione antigene-anticorpo avvenga per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere l'antigene in eccesso e lavare la piastra come dimostrato. Quindi, diluire i campioni di test del siero umano e fare riferimento ai controlli sierici positivi e negativi.
Quindi, aggiungere 100 microlitri dei campioni di prova diluiti e dei controlli nei pozzetti e nei duplicati appropriati. Contrassegnare i pozzetti che non contengono né antigene né sieri come vuoti. Dopo aver incubato la piastra per 90 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di siero e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
Pipettare 100 microlitri dell'enzima diluito appropriato coniugato anticorpi di rilevamento a ciascun pozzetto e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius al buio. Dopo aver rimosso i corpi di rilevamento non legati e lavato la piastra, aggiungere 100 microlitri di soluzione di cromogeno TMB per visualizzare il legame antigene-anticorpo. Lasciare sviluppare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, interrompere la reazione aggiungendo 100 microlitri di acido solforico al 7,5%. Infine, leggere l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre e ordinare i risultati in base al calcolo dell'indice di positività. L'analisi immunoblot tra l'antisiero policlonale non adsorbito Mycoplasma pneumoniae e gli antigeni batterici eterologhi ha rivelato una cross-reattività ma con intensità variabile.
Ad esempio, gli antigeni Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma imitans hanno mostrato la reattività più forte nonostante siano micoplasmi aviari. Al contrario, nessuno dei due isolati clinici umani di Ureaplasma urealyticum ha mostrato alcuna reazione. Tuttavia, gli antigeni delle restanti specie di micoplasma genitale umano e di altri antigeni batterici hanno prodotto notevoli reazioni crociate con l'antisiero.
L'analisi immunoblot ha confermato l'efficacia dell'adsorbimento policlonale antisierico Mycoplasma pneumoniae contro gli antigeni batterici eterologhi. La procedura di adsorbimento ha eliminato tutte le reazioni crociate, rendendo così l'antisiero Mycoplasma pneumoniae specifico per tutti i successivi test sierologici e immunoblotting. Inoltre, il set di sieri umani testato utilizzando l'ELISA di cattura dell'antigene sviluppato in questo studio si è dimostrato positivo per Mycoplasma pneumoniae IgG con buona specificità.
La specificità di questo ELISA è assicurata principalmente dalla tecnica di adsorbimento, in quanto è fondamentale eseguire questo passaggio critico con attenzione e ripeterlo almeno due o tre volte. Il principio di questa tecnica può essere applicato per diagnosticare altre specie di micoplasma o altri batteri in generale. Tuttavia, la selezione degli antigeni batterici per l'adsorbimento dovrebbe essere irrilevante e adeguata.
