We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. Preparazione dei Media, Reagenti e cellulare Cultura Condizioni <ol><li> HEK umano 293 cellule renali di embrioni <ol><li> Cultura HEK 293 cellule (CRL-1573, ATCC) in F-12 a medio DMEM / di Ham integrato con 5% FCS, L-glutammina (2 mm), e la penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mg / ml). </li><li> Per il passaggio delle cellule, lavare le cellule una volta con PBS, aggiungere 0,05% tripsina / EDTA e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g) e trasferire circa 5x10 5 cellule in un pallone di coltura fresco T25. </li></ol></li><li> Fibroblasti embrionali murini (MEF) <ol><li> Aggiungere 1 ml di una soluzione di gelatina 0,1% ai singoli 6-pozzetti ed incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora. Aspirare liquido e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Culture MEF in DMEM supplementato con 10% FCS, L-glutammina (2 mM), L-glucosio (4,5 g / l), piruvato di sodio (1 mM), e la penicillina (100 U /ml) / streptomicina (100 mcg / ml) su piastre da 6 pozzetti rivestiti di gelatina. </li><li> Distribuire MEF in 6 pozzetti e farli crescere fino a confluenza. Aggiungere mitomicina (5 mg / ml) per 2,5 ore per arrestare cellule. Aspirare il terreno, lavare le cellule due volte con media MEF completo e aggiungere 3 ml di mezzo MEF per ogni 6-bene. Queste cellule servono come alimentatore strati per cellule murine e IPS suina. </li></ol></li><li> Cultura di ES murine e cellule iPS <ol><li> Per preparare topo ES terreno di coltura, integrare terreno DMEM con 15% FCS, L-glutammina (2 mM), L-glucosio (4,5 g / l), aminoacidi non essenziali MEM (1X), β-mercaptoetanolo (0,1 mM) e fattore inibitorio della leucemia (1.000 U / ml). </li><li> Sciacquare 6-pozzetti con MEFs crescita arrestato una volta con DMEM senza siero, aggiungere 2 ml di topo ES medio e cellule iPS murine (20% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno le cellule lavare una volta con DMEM senza siero e aggiungere 2 ml di mouse fresco ES medie. </li><li> Per il passaggio delle cellule, lavare i pozzetti una volta con DMEM senza siero, aggiungere 0.25% Tripsina / EDTA e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in un tubo 15 ml, centrifugare per 5 min a 1.200 giri (300 x g), Risospendere le cellule in 500 microlitri topo ES medio e aggiungete 100 ml di sospensione di 2 ml di topo ES medie un nuovo 6-bene con una MEF alimentatore-layer. </li></ol></li><li> Cultura di maiale cellule ips <ol><li> Per preparare maiale iPS medio, integrare DMEM / Ham F-12 di media con il siero del 20% a eliminazione diretta, L-glutammina (2 mm), aminoacidi non essenziali MEM (1X), β-mercaptoetanolo (0,1 mm), e la penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mcg / ml). Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C per 2 o 3 settimane. Al primo utilizzo, aggiungere bFGF (10 ng / ml concentrazione finale). </li><li> Sciacquare 6-pozzetti con MEFs crescita arrestato una volta con DMEM senza siero / Ham F-12 e aggiungere 1,5 ml di maiale iPS medie e suina cellule ips (il 10% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / Ham F-12 e aggiungere 1,5 ml di maiale fresca iPS medie. </li><li> Per preparare tampone di dissociazione aggiungere 2,5% tripsina, collagenasi IV (10 mg / ml), siero knockout (20%) e CaCl 2 (1 mM) per Ca 2+ -free PBS. Lavare le cellule due volte con PBS e incubare con tampone di dissociazione per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in una provetta 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g). </li><li> Risospendere le cellule iPS suina in 500 microlitri suine fresche iPS medio e aggiungete 50 ml di sospensione di 1,5 ml maiale iPS medie un nuovo 6-bene con un alimentatore MEF-layer. Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / F-12 e aggiungere 1,5 ml di prosciutto di maiale fresco iPS media. </li></ol></li><li> Cultura libera-Feeder di cellule iPS umane <ol><li> Scongelare il flacone originale contenente la preparazione membrana basale a 4 ° C e diluire con gelida senza siero DMEM / Ham F-12 a 8 mg / ml, aliquota e conservare a -20 ° C fino a nuovo uso. </li><li> Scongelare una aliquota di basezione preparazione membrana a 4 ° C e diluire con DMEM / F12 ghiacciata senza siero di Ham (90 mcg / ml). Pipettare 1 ml di questa soluzione in 3 cm capsule di Petri e miscelare delicatamente per assicurare che l&#39;intera superficie è coperta. Sigillare piatti con parafilm e conservare a 4 ° C per un massimo di una settimana. Prima l&#39;uso di colture cellulari incubare piatti per 30 min a 37 ° C o 3 ore a temperatura ambiente per permettere la polimerizzazione del preparato membrana basale. </li><li> Aspirare medio dai piatti rivestito con la preparazione membrana basale e lavare due volte con DMEM senza siero / Ham F-12. Aggiungere 1,5 ml E8 medio piatto cultura e cellule iPS umane (10% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / F-12 e aggiungere 1,5 ml di mezzo E8 fresco di Ham. </li><li> Per il passaggio delle cellule, lavare i piatti due volte con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / EDTA 0,5 mm. Incubare i piatti per 5 minuti a temperatura ambiente. Monitorare le cellule al microscopio. Nota: Quando le colonie cominciano a radunare e APPEar di avere buchi che sono pronti per il trasferimento. </li><li> Aspirare il liquido, aggiungere 1,5 ml E8 medio e staccare le cellule pipettando gentilmente su e giù. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g), risospendere in 500 microlitri E8 medio e aggiungere 50 ml di sospensione di 1,5 ml E8 medio in un piatto di coltura fresco rivestito con la preparazione membrana basale . </li></ol></li></ol> 2. Progettazione di target sequenze tra le specie Borders <ol><li> Selezionare umano di riferimento, murino e sequenze di cDNA suina dei geni bersaglio (GAPDH, Nanog, GDF3) ed eseguire un allineamento CLUSTAL analisi multi-sequenza. Nota: Questo indicherà le sequenze omologhe tra le specie. <ol><li> Utilizzare le seguenti impostazioni per l&#39;allineamento multiplo: gap penalty (fisso) 10, gap penalty (variabile) 5, la transizione ponderazione dello 0, gamma divario pena di separazione 8% di identità per il ritardo di 40, massimo numero di iterazioni da eseguire 3. </li></ol></li><li> Invia sequenze target desiderati al produttore (vedi Tabella dei Materiali) per la progettazione e la produzione della sonda. Nota: Il produttore sarà quindi confermare la compatibilità di sequenza desiderata con la tecnologia. Se sequenza desiderata non è compatibile, il produttore suggerisce sequenze alternative. <ol><li> Assicurarsi che le regioni omologhe che possono essere usati come potenziali sequenze di acquisizione dei filamenti hanno una lunghezza di 27 bp. Nota: Si consiglia di ordinare diversi nanoparticelle con diversi filoni di cattura per un gene bersaglio selezionato come solo il vero esperimento cellulare darà una prova definitiva della funzionalità di una sequenza individuale. Quindi, due sequenze differenti per GAPDH e GDF3 stati valutati mentre tre differenti nanoparticelle sono stati testati per valutare l&#39;espressione NANOG. La loro posizione e le sequenze esatte sono state pubblicate altrove 17. Il produttore produce commercialmente il nanoparticoli con le sequenze desiderate e li fornisce in formato liofilizzato. </li></ol></li></ol> 3. Ricostituzione di nanoparticelle e aggiunta di colture cellulari <ol><li> Conservare nanoparticelle liofilizzati sulla ricevuta a 4 ° C al buio. </li><li> Ricostituire nanoparticelle mediante aggiunta di 50 microlitri di acqua bidistillata che dà una concentrazione finale di 100 nM. Una volta ricostituito negozio nanoparticelle a RT al buio. Nota: In questa condizione sono stabili per almeno un anno. Conservazione dei campioni ricostituiti a 4 ° C può influire negativamente sulla loro stabilità. </li><li> Pre-diluire la soluzione di nanoparticelle magazzino con PBS a una concentrazione di 2 (cellule HEK 293) o 8 Nm (iPS e le cellule ES), il giorno di applicazione. Nota: Questa concentrazione è di 20 volte superiore alla concentrazione finale nel piatto cultura. Nelle cellule ES e le cellule iPS, 400 pM di nanoparticelle indotto un segnale fluorescente facilmente rilevabile sotto il microscopio. Per HEK 293 cellule, aconcentration di 100 pM è sufficiente. </li><li> Dispensare 12.5 ml di nanoparticelle prediluiti a un 24-pozzetti contenenti 237,5 ml terreno di coltura cellulare completo. Per i pozzi di dimensioni diverse, regolare i volumi di conseguenza. Agitare accuratamente la piastra per garantire un&#39;equa distribuzione delle nanoparticelle. Incubare le cellule overnight (O / N) a 37 ° C e 5% di CO 2 in atmosfera umidificata. </li><li> Il giorno dopo l&#39;analisi di colture cellulari per gene-specifico Cy3 fluorescenza con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 546 nm (emissione 575-640 nm) sotto un microscopio a fluorescenza. Nota: Il tempo necessario per ottenere un sufficiente forte fluorescenza può dipendere dal tipo di cellula e il gene bersaglio. In questi esperimenti, questa è stata osservata tra 16 e 20 ore dopo l&#39;applicazione della sonda. </li></ol> 4. Identificazione di Cy3 positivi cellule popolazioni mediante citometria di flusso <ol><li> Crescere HEK 293 o cellule ES murine utilizzando le condizioni di cui al punto 1.1 o 1.3, respectively. Un giorno prima della FACS aggiungere GAPDH nanoparticelle specifico d&#39;a diverse concentrazioni di cellule HEK 293 (vedere Figura 6A) e a 400 pM murino cellule ES. Incubare le cellule O / N a 37 ° C e 5% di CO 2 in atmosfera umidificata. </li><li> Analizzare colture cellulari per specifici gene della fluorescenza indotta Cy3 al microscopio a fluorescenza. </li><li> Staccare HEK 293 cellule, come specificato al punto 1.1.2. Centrifuga, il trasferimento in una provetta da 1,5 ml e risospendere in 200 ml ghiacciata PBS / 0,5% BSA / 2 (tampone FACS) mm EDTA. Mantenere celle buie in ghiaccio fino citometria a flusso. </li><li> Staccare cellule ES murine come specificato al punto 1.3.3. Centrifuga, il trasferimento in una provetta da 1,5 ml e risospendere in 200 ml ghiacciata PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Mantenere celle buie in ghiaccio fino citometria a flusso. </li><li> Premere le cellule attraverso un filtro 30 micron a prevenire l&#39;aggregazione cellulare e aggiungere ioduro di propidio (concentrazione finale 2 mg / ml) 2 minprima dell&#39;analisi FACS di escludere le cellule morte. </li><li> Per analizzare le cellule Cy3-positive primo set cancelli gerarchici sul FSC-A / SSC-A sottoinsieme, il FSC-H / FSC-W-sottogruppo e il sottoinsieme SSC-H / SSC-W. Utilizzare l&#39;attaccante e la dispersione lato di escludere detriti cellulari e le cellule che non sono sparsi. Escludere le cellule morte dalla loro colorazione ioduro di propidio visualizzazione PE verso PE-Texas Red. Eseguire il cancello sorta finale sulle cellule positive Cy3-PE (Figura 4). </li></ol>

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HL ha ricevuto le nanoparticelle da Merck Millipore Corporation gratuitamente. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Il presente lavoro descrive l&#39;uso di fluorescenza etichettati nanoparticelle che consentono la valutazione affidabile dell&#39;espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive di diverse specie di mammiferi con diversa origine istogenetica sotto un microscopio a fluorescenza. Questo approccio ha un paio di vantaggi rispetto ad altri metodi pubblicati. Innanzitutto il ricercatore non è limitato in relazione sia gene bersaglio o tipo cellulare. Tutti i metodi di rilevamento di anticorpi base sono limitati a un singolo epitopo. Sebbene beacon molecolari fluorescenti possono anche essere progettati per un ampio spettro di geni, questo metodo richiede la dissociazione delle cellule e la successiva nucleofection 15. Al contrario, l&#39;applicazione di nanoparticelle gene-specifici non richiede alcuna manipolazione della cellula bersaglio che avvolge le nanoparticelle attivamente per endocitosi. Durante la successiva passaging le particelle d&#39;oro gradualmente lasciano le cellule e la cultura possono essere utilizzati in downstream esperimenti. Tuttavia, anche la tecnologia presenta ancora alcuni limiti. Alcuni marcatori non sono ovviamente rilevabili causa della loro natura di carboidrati come SSEA-1 o TRA-1-81 20. Attualmente, una vasta gamma di nanoparticelle è disponibile in commercio. Queste particelle sono state pre-testato per la loro funzionalità in esperimenti cellulari. L&#39;obiettivo del presente lavoro è stato quello di progettare sonde personalizzate che possono essere utilizzati tra le specie delle frontiere. Quando si seguono un tale approccio o quando si progetta una sonda per un romanzo un gene bersaglio deve essere consapevoli del fatto che la funzionalità di un in silico predetto sonda deve essere attentamente valutata in vitro. La sonda Nanog-SF3 che ha mostrato una omologia del 100% per l&#39;omologia sequenza non ha funzionato affatto, mentre Nanog-SF1 con una base non corrispondenti nel murino e la sequenza suina ha prodotto un segnale di bel fluorescenza. Un&#39;altra questione riguarda l&#39;assorbimento efficiente delle nanoparticelle. Le particelle entranole cellule per endocitosi, un processo che è influenzata dalle dimensioni delle nanoparticelle 21, il tipo di cellula e lo stato di differenziazione 22 e la capacità cellulare per eseguire phago- e macropinocitosi 23. La concentrazione ottimale per ottenere un segnale di fluorescenza soddisfacente deve essere testati per ogni singola applicazione o linea cellulare. A tal fine, il primo esperimento deve sempre essere l&#39;applicazione del controllo assorbimento di valutare la compatibilità delle sonde all&#39;interno dei tipi di cellule e condizioni di coltura prima di passare rilevazione dell&#39;espressione genica specifica destinazione. Un punto critico per ottenere risultati affidabili quando si applica questo protocollo per una linea cellulare romanzo o popolazione di cellule è l&#39;inclusione di controlli adeguati. Il controllo assorbimento mai fluorescenti fornirà una indicazione che le concentrazioni di nanoparticelle indurranno un segnale fluorescente sufficiente nella popolazione di cellule bersaglio. La fluorescenza deve essere valutared il giorno successivo, il segnale si esaurirà con il tempo 17. Allo stesso tempo, il controllo corsa senza un omologo nel genoma eucariotico applicata ad una concentrazione identica deve indurre un segnale di fondo trascurabile. Come terzo controllo è consigliabile utilizzare una nanoparticella specifica per un gene housekeeping (GAPDH esempio, β-actina). Queste nanoparticelle servono come controllo positivo che l&#39;approccio può essere utilizzato per rilevare l&#39;espressione genica specifica nella popolazione di cellule bersaglio selezionato. Se questi controlli risultano una soddisfacente si può aspettare di ottenere segnali fluorescenti specifiche affidabili utilizzando nanoparticelle specifici per altri geni bersaglio. La concentrazione delle nanoparticelle applicate può anche essere critico come hanno dimostrato di down-regolare la sequenza bersaglio 24. Tuttavia, questo effetto richiede concentrazioni molto più elevate (5 nM) rispetto alle concentrazioni usate negli esperimenti qui presentati (400 pM). A questa concentrazione il nanoflares non influiscono gene bersaglio mRNA o livelli di proteine ​​e concentrazioni elevate come 2 nm non compromettere la proliferazione di HEK293 e cellule ES murine 17. Inoltre, tutta una analisi di espressione del genoma non ha rivelato cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica 25. Pertanto, a concentrazioni fino a 1 nM le nanoflares non devono presentare alcun effetto avverso importanti. Un&#39;applicazione molto promettente di questa tecnologia è la possibilità di etichettare qualsiasi popolazione di cellule che è caratterizzato da un gene specifico. Recentemente, nanoparticelle gene-specifici sono stati utilizzati con successo per colorare selettivamente miociti ventricolari in diretta 26, sottopopolazioni di cellule di melanoma 27, 28 e monociti cellulari cerebellare culture 29. Tali popolazioni di cellule fluorescenza marcati possono essere ordinati e purificati mediante citometria a flusso delle cellule come vive. Nel campo dell&#39;oncologia è immaginabile per isolare le cellule tumorali metastatiche vivo in modelli animalisulla base della loro espressione di CEA, più prezioso per la ricerca del potenziale metastasi promuovere geni o strutture bersaglio. Abbiamo recentemente dimostrato che veramente riprogrammati murine iPS colonie possono essere identificati in situ con Nanog nanoparticelle specifico d&#39;basati sulla fluorescenza rilevata 17. Pertanto, l&#39;identificazione delle colonie IPS veramente riprogrammati potrebbe essere eseguita su piattaforme high throughput, che utilizzano il rilevamento della fluorescenza robotica e dispositivi di prelievo per identificare le colonie più promettenti. Questa tecnologia sembra essere adatto in molte aree di ricerca per selezionare sottopopolazioni cellulari specifici e sembra possibile applicare le nanoparticelle nelle piattaforme high throughput. In conclusione, questo protocollo rappresenta un nuovo approccio con fluorescenza etichettati nanoparticelle che permette la rilevazione dell&#39;espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive. Questa tecnologia può essere un valido strumento per purificare, espandere e ulteriore carattereize sottopopolazioni cellulari rare in molte aree di ricerca.

Nel 2006, un nuovo approccio è stato descritto per riprogrammare le cellule somatiche in uno stato pluripotente. Dopo preselezione di una serie di fattori di potenziale riprogrammazione fibroblasti murini potrebbero essere convertiti con successo alle cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) di trasduzione retrovirale e sovraespressione di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Successivamente questa tecnica è stata efficacemente riprodotto utilizzando cellule somatiche di diverse specie di mammiferi, tra cui gli esseri umani 2, scimmie 3, ratti, cani 4 5 6, pecore e maiali 7. Inoltre, modificati i protocolli omettendo o sostituzione del fattore di trascrizione potenzialmente oncogenico c- MYC sono stati pubblicati 8, 9. Indipendentemente dalla riprogrammazione iniziale avvicinarsi al vero pluripotenza crescita di colonie deve essere confermata, un&#39;operazione laboriosa e richiede molto tempo. Un grave inconvenientedella maggior parte di queste analisi è che non possono essere eseguite su cellule vive. Fattori pluripotenza affermati come OCT4, SOX2, Nanog o REX1 rappresentano fattori di trascrizione si trova nel nucleo e la loro rilevazione richiede la fissazione delle cellule prima di immunoistochimica o lisi cellulare per RT-PCR analisi. 10 - 12 In seguito, queste cellule sono perse per il futuro esperimenti che richiedono culture repliche di ciascuna colonia. Così, una tecnologia per analizzare pluripotency su cellule vive è altamente desiderabile. Diversi approcci possono infatti essere eseguite direttamente sulle cellule vive utilizzando anticorpi diretti contro antigeni basato membrana (ad es. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente riferito coloranti per rilevare fosfatasi 13 o piccole molecole alcaline che specificamente etichettano staminali embrionali (ES) e cellule iPS 14. Tuttavia, gli anticorpi possono tuttavia alterare le cellule e ogni method è limitato a un solo marcatore pluripotenza. Infine, segnali molecolari fluorescenti, oligonucleotidi antisenso doppia forcella con strutture che consentono colorazione vivo di cellule, sono stati descritti 15. Sebbene questo approccio può essere applicato a molti geni, la tecnica richiede nucleofection di una sospensione di cellule singole, che non è applicabile alle crescenti iPS colonie. Un paio di anni fa nanoparticelle gene-specifici sono stati descritti per analizzare l&#39;espressione survivina in SKBR3 cellule di carcinoma mammario umano 16. Questo manoscritto descrive un approccio innovativo romanzo di individuare marcatori pluripotenza in ES live e le cellule iPS attraverso l&#39;utilizzo di nanoparticelle d&#39;oro coniugati. Queste nanoparticelle costituite da una particella centrale oro con un filo di cattura accoppiato trasporta la sequenza di RNA complementare e una ciocca giornalista Cy3-marcato. Il segnale fluorescente del filamento giornalista si spegne dalla particella oro centrale. Inoltre, appropriatananoparticelle servono come controlli negativi e positivi, rispettivamente (Figura 1). Per un&#39;applicazione nanoparticelle sono semplicemente aggiunti al mezzo di coltura (Figura 2) ed entrano nelle cellule tramite endocitosi (Figura 3). Se RNA bersaglio è espresso sposta il filamento giornalista che poi emette un segnale fluorescente. Questo metodo non richiede la manipolazione della cellula bersaglio e l&#39;espressione del gene bersaglio può essere monitorato otticamente sotto un microscopio a fluorescenza direttamente in cellule vive. Inoltre, la tecnologia può essere applicata a qualsiasi gene bersaglio desiderato tra le specie nel caso di cellule iPS e quindi può essere impiegato in molte aree di ricerca diverse. Infine, citometria a flusso analizza consentire l&#39;identificazione e l&#39;arricchimento di cellule positive Cy3.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

In un primo tentativo di verificare ed accertare la rilevazione intracellulare dell&#39;espressione genica specifica in cellule vive utilizzando nanoparticelle abbiamo deciso di condurre esperimenti pilota con un house-keeping costitutivamente espresso gene (GAPDH) di HEK 293 cellule umane. La concentrazione di nanoparticelle utilizzati in questi esperimenti è stata scelta secondo le raccomandazioni del fabbricante. L&#39;aggiunta di una sonda -specific GAPDH al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 pM indotta una chiara Cy3 fluorescenza in queste cellule, che era visibile sotto un microscopio a fluorescenza dopo O / N incubazione (Figura 5A). Due controlli sono stati inclusi in questi esperimenti per dimostrare il risultato. Uno di controllo comprende un cosiddetto nanoparticelle &quot;scramble&quot; dove il filamento giornalista non ha una sequenza corrispondente in cellule di mammifero o eucariotiche. Il nanoparticelle &quot;scramble&quot; determina lo sfondo non specifico fluorescence causa di possibile degradazione della sonda o tempra incompleta della fluorescenza. L&#39;aggiunta della sonda scramble prodotto un unico segnale marginale fluorescente, che è trascurabile (Figura 5B). Un controllo &quot;assorbimento&quot; permanentemente fluorescente aiuta a determinare la capacità delle cellule di incorporare le nanoparticelle per endocitosi che può variare tra i diversi tipi cellulari. Queste particelle controllo positivo ha prodotto un segnale fluorescente in cellule HEK 293 (Figura 5C). Così, è stata confermata la fattibilità della tecnologia per registrare un segnale fluorescente specifica di un gene intracellulare con un segnale di fondo trascurabile. Va detto che la differenza tra il segnale di fondo e la fluorescenza specifica diminuisce nel tempo. Lo sfondo incrementi per sondare il degrado o tempra incompleta mentre la fluorescenza specifica sfuma gradualmente (Figura 5D). Le stesse nanoparticelle specifico d&#39;GAPDH hannostato testato in colture primarie di fibroblasti di topo, suina e ovina di origine 17. Queste cellule producono un segnale di fondo molto più alto di cellule HEK 293 mentre la fluorescenza specifica-bersaglio è piuttosto debole, probabilmente a causa della relativamente bassa capacità proliferativa di queste culture. Questi esperimenti pilota ci hanno spinto a utilizzare questa tecnologia per la rilevazione dell&#39;espressione genica pluripotenza in iPS derivate da specie diverse. A tale scopo NANOG e GDF3 stati analizzati, entrambi i quali sono noti per essere espresso in cellule pluripotenti 18. Alle prime cellule iPS derivate da fibroblasti coda punta di un Nkx2.5 enhancer cardiaco topo transgenico linea 19 sono stati studiati. Per entrambi i geni un forte segnale fluorescente è stato ottenuto (Figura 6A) e una trascurabile Cy3 fluorescenza del controllo scramble (dati non mostrati). Risultati simili sono stati ottenuti in cellule iPS umane e suine (Figura 6B e C). È importante sottolineare che il segnale di fluorescenza è stata limitata alle colonie IP e non etichettare i fibroblasti utilizzati come strato alimentatore per mouse e iPS suina (vedi frecce nella Figura 6A e C). L&#39;analisi dell&#39;espressione genica Nanog ha anche rivelato che non tutte le sequenze previsto in silico di essere &quot;buona&quot; finalmente è funzionale. Uno dei tre progetti di un NANOG nanoparticelle specifico d&#39;indotti quasi nessun segnale fluorescente paragonabile a quella del controllo scramble nonostante una corrispondenza sequenza 100% in cellule iPS murine (Figura 6D). Un risultato simile è stato ottenuto sulle cellule iPS umane e origine suina con questa sonda (dati non mostrati). Così, le nanoparticelle possono essere utilizzati per rilevare l&#39;espressione del gene attraverso pluripotency specie confini mentre la funzionalità di ogni singola sonda progettata deve essere valutata in anticipo. I risultati promettenti del in situl&#39;etichettatura di cellule vive in piatti di coltura cellulare ci ha spinto ad analizzare l&#39;espressione genica quantitativamente mediante citometria a flusso. A tal fine GAPDH nanoparticelle specifico d&#39;sono stati aggiunti a concentrazioni graduate per HEK 293 monostrati al fine di confrontare l&#39;efficienza di etichettatura all&#39;interno della popolazione di cellule bersaglio. Come valutati da un microscopio a fluorescenza maggiore fluorescenza Cy3 indotta è stato visto con la concentrazione più bassa rispetto alle cellule che non hanno ricevuto le nanoparticelle. Concentrazioni crescenti di nanoparticelle indotto una concentrazione dipende chiaramente fluorescenza delle cellule HEK 293 in situ (Figura 7A). Sottoporre queste cellule per l&#39;analisi di citometria di flusso confermato il dipendente efficienza etichettatura concentrazione. La frequenza di cellule positive Cy3 significativamente aumentato (più di sette volte) quando la più alta concentrazione di nanoparticelle è stata applicata (Figura 7B). In ulteriori esperimenti ES cellule dal cardiaco Nkx2.5enhancer transgenici linea di topi 19 sono stati utilizzati per analizzare l&#39;espressione dei geni pluripotenziali mediante citometria di flusso. Esperimenti pilota con 400 pM del controllo assorbimento positivo hanno prodotto chiaramente Cy3 positivi ES vivo colonie sotto il microscopio e citometria a flusso rilevati quasi il 40% di cellule positive Cy3 (Figura 7C). In contrasto, paragonabile a cellule non trattate circa 0,1% di cellule trattate con scramble macchiato positivo (dati non mostrati). Allo stesso modo l&#39;aggiunta di nanoparticelle specifici per GAPDH, Nanog e GDF3 indotto un segnale di fluorescenza distinta in colonie individuali nel piatto di coltura cellulare. La frequenza di cellule positive Cy3 per GAPDH come determinato mediante citometria di flusso era paragonabile a quello visto per entrambi i geni pluripotenza (Figura 7C). Questo risultato è prevedibile come sono anche pensato Nanog e GDF3 essere espresso costitutivamente in cellule ES pluripotenti. Quindi, questi dati chiaramente indiCate che cellule esprimenti un gene particolare possono essere identificati tramite analisi citofluorimetrica, qualitativamente e dalla loro quantità relativa. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura delle nanoparticelle. (A) Struttura di una nanoparticella gene-specifico. (B) nanoparticelle Scramble (controllo negativo). (C) Assorbimento nanoparticelle (controllo positivo). Adattato da Lahm et al. 17, ristampato con il permesso di Wiley. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Figura 2: Applicazione delle nanoparticelle to Cell Cultures Una soluzione diluita di nanoparticelle correttamente viene pipettato semplicemente nel mezzo di coltura.. Dopo O / cellule specifiche del gene incubazione N fluorescenti sono visibili sotto af<html> Microscopio luorescent. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Figura 3:. Uptake attivo di nanoparticelle da parte delle cellule tramite endocitosi (A) Le cellule fagocitare attivamente le nanoparticelle per endocitosi (B) target mRNA si lega al filo di cattura e sposta il reporter fluorescente.. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Figura 4: strategia di gating per citometria a flusso. (A) strategia per HEK 293 cellule. (B) Strategia per le cellule embrionali murine. I dati sono stati acquisiti tramite dispositivo 1 per HEK 293 cellule o dispositivo 2 per le cellule embrionali murine e sono stati successivamente analizzati mediante uno strumento software (vedi Tabella dei Materiali). /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Analisi di GAPDH -expression in cellule HEK 293 A GAPDH nanoparticella -specific inserito le cellule a 100 PM (concentrazione finale) e la fluorescenza è stata registrata dopo O / N incubazione (A) GAPDH nanoparticelle -specifica (B.. ) Scramble (controllo negativo). (C) Assorbimento (controllo positivo). (D) Cinetica di corsa e di controllo assorbimento. La fluorescenza è stata determinata nei punti temporali indicati dopo l&#39;aggiunta di nanoparticelle specifico d&#39;GAPDH. Barre di scala rappresentano 50 micron. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Figura 6:. Analisi di pluripotenza genica in cellule iPS di differenti specie nanoparticelle specifico per Nanog o GDF3 sono stati aggiunti alle cellule a 400 PM (conce finalentration) e la fluorescenza è stata registrata dopo O / N incubazione. (A) cellule murine iPS. (B), le cellule iPS umane. (C), le cellule iPS Suini. Frecce in (A) e (C) designano cellule feeder-layer di fibroblasti non marcato. (D) fluorescenza nelle cellule iPS murine dopo aggiunta del NANOG-design SF3 nanoparticelle. Barre di scala rappresentano 50 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Figura 7: Nanoparticle etichetta cellule vive può essere identificato mediante citometria di flusso. (A) Vista microscopica di Cy3 HEK positivo 293 cellule dopo l&#39;aggiunta di diverse concentrazioni di nanoparticelle. (B) Frequenza di cellule positive Cy3 determinati mediante citometria a flusso. (C) diretta colorazione murine colonie di cellule ES e determinazione della frequenza di Cy3 positiva cellule. Sono stati aggiunti Nanoparticellead una concentrazione finale di 400 pM. Barre di scala rappresentano 50 micron.

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Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

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JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Video: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

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Biologia

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It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

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It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

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This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...