Como para todos os pacientes de micoplasma, o diagnóstico de Mycoplasm pneumoniae é desafiador por causa de reações cruzadas. Nosso ELISA proposto baseia-se na depleção seletiva de antígenos inespecíficos do Mycoplasm pneumoniae usando uma técnica de adsorção. O ELISA de captura de antígeno interno descrito neste vídeo garante alta especificidade espaçosa.
E, na verdade, provou ser um teste rastreado confiável para um diagnóstico preciso da infecção por Mycoplasm pneumoniae. Demonstrando os passos pré-ELISA estará Imen Chniba, um estudante de doutorado. E os passos do ELISA serão Nadine Khadraoui, uma técnica do nosso laboratório.
Para iniciar o procedimento de adsorção de antígenos, puxe os 12 antígenos bacterianos heterólogos para um tubo de microcentrífuga e ajuste a concentração de proteína correspondente à metade do antissoro a ser adsorvido. Em seguida, centrifugar a mistura de antígenos a 14.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius para coletar o pellet. Em seguida, ressuspeite o pellet com o anti-Mycoplasma pneumoniae IgG policlonal purificado e incube por duas horas a 37 graus Celsius com agitação lenta.
No final da incubação, centrifugar a suspensão novamente a 14.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e recuperar o sobrenadante correspondente ao antissoro policlonal específico de Mycoplasma pneumoniae. Para revestir uma placa ELISA de 96 poços com um anticorpo de captura, dilua o anticorpo para 10 microgramas por mililitro e 0,1 tampão de bicarbonato de carbonato molar a pH 9,6. Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo diluído a cada poço da microplaca e incube durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, retire a solução de revestimento e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem. Em seguida, bloqueie as superfícies não ligadas dos poços revestidos adicionando 100 microlitros da solução de bloqueio a cada poço. Depois de incubar a placa a partir de uma hora à temperatura ambiente, retire a solução de bloqueio com uma pipeta e lave a placa como demonstrado anteriormente.
Adicione uma quantidade igual de proteínas inteiras do Mycoplasma pneumoniae a uma concentração de 10 nanogramas por poço e permita que a reação antígeno-anticorpo ocorra por duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o excesso de antígeno e lave a placa conforme demonstrado. Em seguida, diluir as amostras de soro humano e referenciar os controlos séricos positivos e negativos.
Em seguida, adicionar 100 microlitros das amostras de teste diluídas e controles nos poços e duplicatas apropriados. Marque os poços que não contêm antígeno nem soros como em branco. Depois de incubar a placa por 90 minutos à temperatura ambiente, remova a solução sérica e lave a placa cinco vezes com o tampão de lavagem.
Pipetar 100 microlitros dos anticorpos de detecção conjugados da enzima diluída apropriada para cada poço e incubar por uma hora a 37 graus Celsius no escuro. Depois de remover os corpos de detecção não ligados e lavar a placa, adicione 100 microlitros de solução de cromogênio TMB para visualizar a ligação antígeno-anticorpo. Deixe a placa se desenvolver por 30 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, pare a reação adicionando 100 microlitros de ácido sulfúrico a 7,5%. Finalmente, leia a absorbância a 450 nanômetros usando um leitor de microplacas e classifique os resultados com base no cálculo do índice de positividade. A análise de immunoblot entre o antissoro policlonal não adsorvido de Mycoplasma pneumoniae e antígenos bacterianos heterólogos revelou reatividade cruzada, mas com intensidade variável.
Por exemplo, os antígenos Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma imitans apresentaram a reatividade mais forte, apesar de serem micoplasmas aviários. Em contraste, nenhum dos dois isolados clínicos humanos de Ureaplasma urealyticum mostrou qualquer reação. No entanto, antígenos das espécies remanescentes de micoplasma genital humano e outros antígenos bacterianos produziram reações cruzadas consideráveis com o antissoro.
A análise de immunoblot confirmou a eficiência da adsorção antissérica policlonal do Mycoplasma pneumoniae contra os antígenos bacterianos heterólogos. O procedimento de adsorção eliminou todas as reações cruzadas, tornando o antissoro Mycoplasma pneumoniae específico para todos os testes sorológicos e de immunoblotting subsequentes. Além disso, o conjunto de soros humanos testados usando o ELISA de captura de antígeno desenvolvido neste estudo mostrou-se positivo para Mycoplasma pneumoniae IgG com boa especificidade.
A especificidade deste ELISA é assegurada principalmente pela técnica de adsorção, pois é primordial realizar esta etapa crítica com cuidado e repeti-la pelo menos duas ou três vezes. O princípio desta técnica pode ser aplicado para diagnosticar outras espécies de micoplasma ou outras bactérias em geral. No entanto, a seleção de antígenos bacterianos para adsorção deve ser irrelevante e adequada.
