Questo è il primo protocollo ottimizzato per isolare nuclei di alta qualità per esperimenti di sequenziamento di singoli nuclei utilizzando cervelli congelati di killifish turchese africano, un modello di vertebrato emergente per la ricerca sull'invecchiamento. Questo protocollo isola i nuclei molto delicatamente, il che lo distingue dai protocolli più duri ottimizzati per altri organismi con cervelli più mielinici, che si traducono in nuclei degradati quando usati nel killifish. Questo metodo sarà fondamentale per aiutarci a comprendere l'invecchiamento cerebrale a livello di singola cellula.
Dovrebbe tradursi bene in altri tessuti che richiedono un isolamento dei nuclei più delicato. Questo protocollo è facile da usare. Il compito più impegnativo è la centrifugazione a gradiente per la rimozione dei detriti, in cui è meglio essere lenti e precisi che veloci e disordinati.
A dimostrare la procedura saranno Ari Adler e Brian Teefy, un tecnico di laboratorio di ricerca e uno studioso post-dottorato del laboratorio di Benayoun. Dopo aver sezionato il killifish, scongelare il tessuto cerebrale congelato sul ghiaccio per 10 minuti e rimbalzare il cervello in un millilitro di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati in un omogeneizzatore di dounce da due millilitri. Durante la lisatura del campione, tenere l'omogeneizzatore sul ghiaccio ed evitare di generare bolle.
Ripulire il tessuto come descritto nel manoscritto e lasciare riposare il campione sul ghiaccio nell'omogeneizzatore di dounce per due minuti. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri preverniciato con 5% BSA. Aggiungere quattro millilitri di tampone di lavaggio nuclei al campione pipettando il tampone di lavaggio sul filtro cellulare da 70 micrometri e mescolare invertendo delicatamente il tubo cinque volte.
Utilizzando un rotore a benna oscillante, centrifugare il campione a 500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante versandolo delicatamente in un contenitore di rifiuti liquidi. Tenere il campione in posizione verticale e rimuovere il tampone di lavaggio rimanente utilizzando una pipetta P1000.
Risospendere immediatamente i nuclei in un millilitro di tampone di lavaggio dei nuclei con una punta per pipetta P1000 ad ampio foro. Quindi, portare il campione a cinque millilitri aggiungendo quattro millilitri di tampone di lavaggio dei nuclei e miscelare come dimostrato in precedenza. Pellettare la cella mediante centrifugazione.
Eliminare il surnatante e risospendere i nuclei in un millilitro di tampone di lavaggio dei nuclei con una punta di pipetta ad ampio foro. Ora, trasferire i nuclei in un tubo di citometria a flusso. Aggiungere 300 microlitri di soluzione di rimozione dei detriti alla sospensione cellulare e mescolarla accuratamente mediante pipettaggio con una punta larga fino a quando la miscela è omogenea.
Tenere il tubo con una leggera angolazione e sovrapporre delicatamente un millilitro di tampone di lavaggio nuclei sopra la soluzione nucleica utilizzando una pipetta P1000. Centrifugare il campione in un rotore a benna oscillante a 3000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare completamente le due fasi superiori utilizzando una pipetta P1000.
Trasferire lo strato inferiore in un tubo conico da 15 millilitri preverniciato con 5% BSA. Quindi, portare il volume a 15 millilitri con tampone di lavaggio nuclei e mescolare invertendo il tubo tre volte. Centrifugare il tubo a 1000G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a benna oscillante.
Rimuovere accuratamente il surnatante e risospendere immediatamente il pellet in 150 microlitri di tampone di lavaggio nuclei utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro. Passare a una punta per pipetta standard impostata su 300 microlitri. Pipettare l'intero campione e quindi collegare un filtro on-tip da 40 micrometri all'estremità della punta della pipetta.
Filtrare il campione espellendo con forza il campione attraverso il filtro in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame del DNA. In una provetta FACS, risospendere 10 microlitri del campione di nuclei filtrati in 90 microlitri del tampone citometrico a flusso raccomandato. Colorare i campioni con ioduro di propidio ad una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro.
Dopo aver configurato l'area di lavoro come descritto nel manoscritto, avviare il flusso premendo l'icona di riproduzione nell'angolo in basso a destra. Verificare la presenza di bolle d'aria o grumi nel campione utilizzando l'area di dispersione laterale rispetto all'HDRT. Inoltre, controllare il grafico a dispersione laterale rispetto al grafico a dispersione in avanti per verificare che gli eventi si stiano accumulando entro i limiti della finestra.
Per ingrandire, fare doppio clic sull'area di dispersione laterale rispetto al grafico PerCP-Vio700-A. Fare clic sul pulsante sulla barra degli strumenti in alto a sinistra con una linea perpendicolare per selezionare un cancello del quadrante. Quindi, fare clic in un punto qualsiasi dell'area di dispersione laterale rispetto al grafico PerCP-Vio700-A e i quadranti appariranno all'interno del grafico.
Fare clic in un punto qualsiasi delle linee divisorie del quadrante e far scorrere il cursore per modificare il posizionamento del quadrante. Posizionare i quadranti in modo tale che il quadrante in alto a sinistra contenga detriti e il quadrante in alto a destra contenga nuclei. Fare clic sull'icona quadrata, grigia, I per aprire la finestra delle proprietà.
Vai alla scheda Funzioni regione e assicurati un segno di spunta verde accanto all'elemento superiore, che indica che l'intero grafico è selezionato. Sotto l'elenco delle funzioni, fare clic su conteggio per microlitro per produrre un segno di spunta verde. Fare clic su OK e ogni quadrante visualizzerà un conteggio per metrica microlitro.
Selezionare il conteggio e la percentuale totale dalla scheda delle funzioni dell'area per visualizzare i conteggi e le percentuali non elaborati, se lo si desidera. Disegna una porta poligonale attorno a questa popolazione facendo clic sul pulsante poligono sulla barra degli strumenti in alto a sinistra. Quindi, fai clic una sola volta e fai scorrere il mouse per disegnare un segmento lineare del cancello.
Fare nuovamente clic per terminare e iniziare il successivo, seguito da un doppio clic per completare il cancello. Fare clic sul bordo del cancello e far scorrere il mouse per riposizionarlo. Fare clic sui vertici del cancello per modificare la forma e verranno visualizzati i conteggi per microlitro della popolazione controllata.
I nuclei sani che sono apparsi come nuclei di singoletto con membrane intatte sono adatti per l'analisi a valle. Tuttavia, i nuclei malsani sono caratterizzati da membrane nucleari danneggiate, che portano all'aggregazione dei nuclei e possono contribuire ai segnali di fondo nelle applicazioni a valle. I nuclei sono in forma singoletta e multipletto nel quadrante in alto a destra, con i singoletti come la nube più bassa di eventi seguita da doppietti e terzine in ordine crescente.
I detriti sono contrassegnati da eventi nei due quadranti più a sinistra in una preparazione di nuclei di bassa qualità in cui la fase di rimozione dei detriti è stata omessa. I detriti costituiscono oltre il 40% degli eventi. Tuttavia, in un esperimento di alta qualità, i detriti costituiscono meno del 15% di tutti gli eventi.
È imperativo rimuovere completamente lo strato intermedio dopo la fase di centrifugazione di rimozione dei detriti per ridurre la contaminazione dell'RNA di fondo I nuclei isolati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo o il sequenziamento ATAC per ottenere informazioni trascrittomiche ed epigenetiche a livello di singola cellula. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare la regolazione genica del cervello a livello di singola cellula nel killifish turchese africano, un organismo modello di vertebrati naturalmente di breve durata per la ricerca sull'invecchiamento.
