Questo protocollo facile e riproducibile è stato utilizzato con successo per isolare nuclei di alta qualità da fegati modello murino sani e malati, nonché fegati da primati umani e non umani. Questo metodo richiede solo una piccola quantità di materiale di tessuto congelato. Inoltre, l'incentivazione del grado di densità dà una sospensione nucleare molto pulita con tutti i principali tipi di cellule nel fegato conservati nella preparazione nucleare finale.
Questo metodo di estrazione dei nuclei può essere utilizzato in campioni di fegato umano bio archiviati che sono conservati in biobanche. Inizia l'omogeneizzazione del tessuto tagliando un pezzo di cubo da 2230 milligrammi o cinque millimetri da un tessuto epatico posto nella capsula di Petri su ghiaccio secco usando un bisturi pre-raffreddato. Trasferire immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio umido e aggiungere un millilitro di tampone di omogeneizzazione.
Usando il bisturi freddo, tritare il tessuto il più possibile, permettendogli di aspirare con una punta dell'orifizio larga un millilitro. Raccogliere la sospensione di tessuto e trasferirla in un omogeneizzatore di vetro da due millilitri pre raffreddato. Lavare la capsula di Petri con un ulteriore tampone di omogeneizzazione da 0,521 millilitri e raccogliere tutti i pezzi di tessuto rimanenti mantenendo tutto sul ghiaccio.
Eseguire lentamente e con attenzione cinque colpi con pestello sciolto A sul ghiaccio senza creare bolle. Assicurati che il pestello si muova con attenzione dall'alto verso il basso dell'omogeneizzatore ad ogni colpo. Successivamente eseguire da 10 a 15 colpi lenti con pestello stretto B sul ghiaccio senza creare bolle.
Una volta fatto, filtrare l'omogenato attraverso un filtro cellulare da 50 micrometri mentre lo si trasferisce in un tubo da 1,5 millilitri pre-raffreddato. Utilizzare più di un filtro o tubo per omogenati contenenti un'elevata quantità di grumi di tessuto connettivo. Risciacquare l'omogeneizzatore e i filtri con un ulteriore tampone di omogeneizzazione da 0,521 millilitri per raccogliere accuratamente tutti gli omogenati tissutali prima della centrifugazione del gradiente di densità.
Per la centrifugazione a gradiente di densità, centrifugare l'omogenato filtrato in una centrifuga ad angolo fisso pre-raffreddata a 1000 G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Mentre il campione viene centrifugato, preparare un tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di diluizione del 50% di iodixanolo e un tubo da due millilitri contenente 500 microlitri di diluizione di iodixanolo del 29%. Posizionare entrambi i tubi sul ghiaccio.
Quindi dalla sospensione della centrifuga, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. Risospendere il pellet in 250 microlitri di tampone di omogeneizzazione utilizzando la punta della pipetta dell'orifizio larga un millilitro. Quindi trasferire 250 microlitri della sospensione nucleica in un tubo da 1,5 millilitri pre-raffreddato contenente 250 microlitri di 50% di iodixanolo e mescolarlo delicatamente e accuratamente per generare una sospensione di nuclei di iodixanolo del 25%.
Quindi, trasferire 500 microlitri della sospensione di nuclei di iodixanolo al 25% in un tubo da millilitro pre-raffreddato contenente 500 microlitri di diluizione del 29% di iodixanolo. Centrifugare il tubo in una centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata a 12.500 G per 20 minuti, con la pausa impostata su off. Poco prima che la fase di centrifugazione sia completata, aggiungere gli inibitori degli RNA al buffer di stoccaggio dei nuclei, o NSB mentre si procede verso le pipeline di sequenziamento dell'RNA del singolo nucleo.
Dopo il completamento della centrifugazione, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet utilizzando una pompa per vuoto. Risospendere delicatamente il pellet in 100-300 microlitri di NSB utilizzando la punta del pippet dell'orifizio largo un millilitro e trasferire la sospensione dei nuclei in un tubo pulito da 1,5 millilitri pre-raffreddato. Contare i nuclei utilizzando la soluzione di tripano blu con un emocitometro manuale e utilizzare immediatamente la sospensione di nuclei ottenuta per il test di genomica del singolo nucleo.
Per la selezione cellulare basata sulla citometria a flusso, filtrare la sospensione dei nuclei attraverso un filtro da 50 micrometri in un tubo fax o un tubo fax pre-raffreddato a cinque millilitri di selezione cellulare attivata a fluorescenza. Utilizzare una selezionatrice per citometria a flusso dotata di un ugello da 100 micrometri e caricare il tubo fax sul selezionatore prima di visualizzare in anteprima il campione. Impostare la strategia di gating per l'ordinamento dei nuclei, iniziando con un cancello di dispersione tracciando l'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale, seguita da altezza falsa contro area bufala e quindi larghezza bufala contro area bufalata.
Visualizza il profilo ploidia dei nuclei sull'istogramma dell'area falsificata. Per lo smistamento in piastre da 96 o 384 pozzetti, impostare il ritardo delle gocce e ottimizzare l'allineamento della piastra utilizzando il metodo colormetrico. Impostare il raffreddamento del campione e il supporto della piastra a quattro gradi Celsius con la rotazione del campione attivata a 300 giri/min.
Ordinare i singoli nuclei a una concentrazione del campione di circa una volta 10 al quinto nucleo per millilitro con una portata da 200 a 500 eventi al secondo. L'esame microscopico dei nuclei estratti da fegati congelati ha mostrato che la fase di centrifugazione del gradiente di densità ha notevolmente facilitato la rimozione di detriti cellulari e tissutali indesiderati. Questa metodologia ha preservato tutti i livelli di ploidia, che è stata convalidata e quantificata mediante analisi citometrica.
Metriche di alta qualità sono state osservate dai dati ottenuti utilizzando l'estrazione dei nuclei. L'approssimazione e la proiezione di varietà uniformi rappresentavano il numero di conteggi in tutti i nuclei e nei principali tipi di cellule, che possono essere identificati con sicurezza solo con il trascrittoma nucleare e il sequenziamento relativamente superficiale. Questo approccio ha permesso lo studio dei fattori di trascrizione specifici del fegato e dei geni bersaglio a valle coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici.
Il modello complementare di geni caratteristici come il CYP2E1 percentrale e il periportale CYP2F2 ha mostrato che i nuclei estratti conservavano informazioni critiche sulla donazione di fegato. La libreria di espressione genica dell'RNA è stata sequenziata a una profondità di 44.600 letture per nucleo e la libreria ATAC a una profondità di 43.500 letture per nucleo. Un'analisi ponderata del vicino più vicino eseguita per misurazioni multiple di entrambe le modalità, RNA più ATAC, utilizzando i pacchetti Seurat e Signac ha permesso l'identificazione e l'annotazione dei tipi di cellule epatiche maggiori e minori senza pregiudizi prominenti a causa delle dimensioni delle cellule o della fragilità nucleare.
In questo metodo sono stati rilevati anche i regolatori trascrizionali a monte e i geni caratteristici della donazione di fegato. È importante evitare di creare troppe bolle durante l'omogeneizzazione del piumino quando si spostano i pestelli su e giù, e attenersi al numero di colpi indicato nel protocollo.
