0.Il nostro protocollo descrive un metodo ottimizzato e riproducibile per generare osteoclasti in vitro che può essere utilizzato per studiare i meccanismi alla base del loro processo di differenziazione e funzionalità. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di generare un numero elevato di osteoclasti funzionalmente attivi in una sola settimana. L'alta resa differenziale si ottiene utilizzando monociti purificati e aggiungendo citochine in tempo.
Gli osteoclasti sono responsabili della distruzione ossea in tutte le forme di artrite e questo metodo fornisce gli strumenti per lo screening di nuovi composti terapeutici che possono modulare la loro differenziazione e / o funzioni. A dimostrare la procedura sarà Patricia Riedlova, una dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare, isolare le PBMC trasferendo il sangue in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Diluirlo con PBS sterile in un volume uguale per il sangue fresco o un rapporto 1: 3 per coni leucocitari e manti buffy. Mescolare delicatamente il sangue per inversione. Preparare tubi da 15 millilitri contenenti tre millilitri di mezzo di gradiente di densità e stratificare lentamente da otto a 10 millilitri di sangue diluito sulla parte superiore del mezzo di gradiente di densità, evitando di mescolare.
Centrifugare il tubo a 400 x g per 30 minuti a temperatura ambiente senza freno. Quindi scartare con attenzione lo strato superiore con una pipetta Pasteur. Raccogliere lo strato interfase sottostante contenente le PBMC e trasferire questo strato in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Sospendere le celle fino a 50 millilitri con PBS sterile e lavare via il mezzo del gradiente di densità residuo centrifugando a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente con freno pieno. Per rimuovere le piastrine residue, ripetere il processo di centrifugazione come descritto nel manoscritto, risospendere le PBMC isolate e purificate in 20 millilitri di PBS e contarle utilizzando un ematocitometro seguendo il metodo standard. Per arricchire i monociti CD14+, trasferire 1 x 10 al settimo PBMC in un tubo di polistirene a fondo rotondo adatto e pellettare le cellule a 300 x g per cinque minuti.
Dopo aver scartato il surnatante e risospeso il pellet cellulare nel tampone di separazione cellulare, incubare le cellule con 10 microlitri di cocktail di anticorpi per 100 microlitri con il coperchio acceso per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 10 microlitri di sfere di nanoparticelle magnetiche per 100 microlitri e incubare per tre minuti con il coperchio. Riempire il volume a 2,5 millilitri con il tampone di separazione cellulare.
Posizionare il tubo in un magnete e incubare per tre minuti con il coperchio spento. Ora, scartare la popolazione di cellule negative con un movimento continuo per inversione mentre il tubo è ancora nel magnete. Rimuovere il tubo dal magnete, lavare i monociti CD14+ arricchiti attaccati alle sfere magnetiche risospendendoli in 2,5 millilitri del tampone di sospensione cellulare e riposizionare il tubo nel magnete.
Contare le celle isolate come dimostrato in precedenza. Centrifugare le cellule raccolte a 300 x g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule a 1 milione di cellule per millilitro in mezzo essenziale alfa minimo completo con 10% FBS.
Per differenziare l'osteoclasto, aggiungere M-CSF a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro alla sospensione cellulare e mescolare mediante pipettaggio completo per omogeneizzare la sospensione cellulare. Piastra 100 microlitri della sospensione per pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sterile per pozzetto attorno alle cellule placcate per prevenire l'evaporazione media e gli effetti del bordo nel sistema di coltura.
Incubare le cellule durante la notte per circa 18-20 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Preparare nuovi mezzi integrati con M-CSF e ligando RANK. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura metà del terreno mediante aspirazione utilizzando una pipetta P200 e sostituirlo con un mezzo completo fresco e caldo integrato con legante M-CSF e RANK ad una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro.
Differenziare le cellule in osteoclasti da sette a 14 giorni con una sostituzione completa del terreno ogni tre giorni. Dopo aver rimosso il mezzo, fissare gli osteoclasti aderenti differenziati con 100 microlitri per pozzetto della soluzione fissativa preparata e incubare per un minuto. Non toccare il fondo dei pozzetti per evitare di graffiare le cellule aderenti.
Una volta che i pozzetti vengono lavati tre volte con 300 microlitri di acqua distillata sterile, toccare le piastre asciutte e aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante appena preparata a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius al buio per 20 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione colorante per inversione e lavare la piastra tre volte con 300 microlitri per pozzetto di acqua distillata.
Rimuovere l'acqua in eccesso picchiettando i piatti su carta assorbente e lasciare i piatti aperti e protetti dalla luce all'aria per tutta la notte. Utilizzando un microscopio a campo chiaro con un'opzione di piastrelle, scattare immagini a 10x o 20x per catturare l'intera superficie del pozzo. Contare manualmente gli osteoclasti identificati come cellule colorate di TRAP + viola con più di tre nuclei utilizzando un software di analisi delle immagini con un plug-in di contatore cellulare.
Piastra 100 microlitri dei monociti CD14 + isolati per pozzetto in una camera a 18 pozzetti con una densità cellulare di 1 x 10 alla quinta cellula per pozzetto. Differenziare gli osteoclasti in presenza di M-CSF e ligando RANK come dimostrato in precedenza con un cambio completo del terreno ogni tre giorni. Al punto temporale finale, rimuovere delicatamente il mezzo e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di PBS preriscaldato a pH 7,4.
Non lasciare asciugare i pozzetti tra i gradini. Fissare il campione con 100 microlitri per pozzetto di soluzione di formaldeide al 4% in PBS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con agitazione delicata. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS.
Permeabilizzare le cellule con 100 microlitri per pozzetto di soluzione Triton x-100 allo 0,1% diluita in PBS e incubare per 10 minuti come mostrato in precedenza. Lavare due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS. Per bloccare il legame non specifico e aumentare il segnale, aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante fatta con albumina sierica bovina al 2% e soluzione PBS.
Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con leggero scuotimento. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere 100 microlitri di soluzione di falloidina coniugata fluorescentmente diluita in soluzione al 2% BSA / PBS a ciascun pozzetto. Lavare due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS.
Colorare i nuclei con 100 microlitri per pozzetto di una soluzione di PBS contenente 300 DAPI nanomolari. Dopo 10-15 minuti, rimuovere la soluzione DAPI e sostituirla con PBS da 100 microlitri per pozzetto. Visualizza la colorazione usando microscopi immunofluorescenza o confocali appropriati da quattro a 40x.
Gli osteoclasti maturi sono definiti come cellule nucleate multiple TRAP+. L'aggiunta del ligando RANK ha prodotto un numero crescente di grandi osteoclasti TRAP+multi-nucleati in modo dose-dipendente. La cinetica della differenziazione degli osteoclasti dai monociti è stata studiata in un periodo di coltura da due a 14 giorni.
Gli osteoclasti multinucleati erano visibili dal quinto giorno in poi e la differenziazione ottimale è stata raggiunta il settimo giorno. La differenziazione degli osteoclasti su superfici mineralizzate permette di valutarne l'attività di riassorbimento analizzando la formazione di fori rotondi, o pozzi di riassorbimento. La percentuale di riassorbimento aumenta significativamente in presenza di M-CSF e ligando RANK rispetto al solo M-CSF.
Inoltre, il trattamento con rotenone dose-dipendente ha inibito il riassorbimento della superficie mineralizzata rispetto al pozzo di controllo non trattato. L'inibizione rotenone-dipendente del riassorbimento degli osteoclasti è stata associata all'inibizione della produzione di ATP. La frammentazione dell'anello di actina derivato dal ligando RANK dell'OCS maturo è stata osservata in presenza di rotenone.
È importante assicurarsi che i monociti arricchiti non contengano piastrine, che le cellule siano placcate alla giusta densità e che i pozzetti circostanti siano riempiti d'acqua per evitare l'effetto bordo. Questo protocollo è particolarmente utile per interrogare meccanicamente come si formano gli osteoclasti e cosa influenza la loro funzionalità sia nella scienza di base che traslazionale. Ad esempio, utilizzando composti o proteine in grado di modulare questi processi.
