La matrice extracellulare o le microparticelle numeriche di idrogel ECM possono essere utilizzate come elementi costitutivi per la fabbricazione di impalcature. Questo protocollo dimostra la fabbricazione, la purificazione, la liofilizzazione, l'assemblaggio fotografico e la biostampa 3D di microparticelle di gelatina metacrilico o idrogel GelMA. GelMA è un biopolimero fotochimicamente, reticolabile, a base di proteine contenente adesivo cellulare e porzioni biodegradabili che è stato ampiamente utilizzato come biomateriale sensibile alle cellule e istruttivo.
Rispetto all'idrogel sfuso convenzionale, gli scaffold di idrogel granulare GelMA sono microporosi, consentendo una rapida infiltrazione cellulare che può essere adattata alle dimensioni del blocco di costruzione. Gli scaffold di idrogel granulare GelMA possono aprire nuove opportunità per la bioprinting 3D di tessuti, organi e malattie spessi su piattaforme economiche e ingegneria rigenerativa. Per iniziare, aggiungere 10 milligrammi di LAP a 10 millilitri di DPBS per preparare una soluzione fotoiniziatore allo 0,1%.
Proteggere la soluzione dalla luce avvolgendola con un foglio di alluminio ed etichettarla. Quindi, sciogliere la quantità desiderata di GelMA nella soluzione di fotoiniziatore. Posizionare la soluzione avvolta in fogli di alluminio nel forno a 37 gradi Celsius per un'ora per ottenere una soluzione limpida.
Per preparare la fase oleosa, creare una soluzione di tensioattivo biocompatibile al 2% nel fluido tecnico. Inserire il tubo Tygon negli ingressi e nelle uscite del dispositivo PDMS, quindi inserire un ago smussato calibro 25 nell'altra estremità del tubo Tygon per gli ingressi. Posizionare il dispositivo sotto il microscopio e mantenere l'ambiente caldo a circa 40 gradi Celsius utilizzando un asciugacapelli o una stufa.
Caricare le soluzioni acquose e oleose in siringhe separate collegate al dispositivo. Avviare la pompa a siringa per la fase oleosa con una portata di 160 microlitri al minuto. Dopo che l'olio ha riempito il canale, avviare la fase acquosa a 80 microlitri al minuto.
Controllare la formazione di goccioline al microscopio. Raccogliere le goccioline in un contenitore e valutarle nella camera di imaging mediante microscopia ottica. Mantenere le goccioline a quattro gradi Celsius durante la notte proteggendole dalla luce per avviare la reticolazione fisica del microgel GelMA e convertire le goccioline in microgel stabili.
Per implementare il metodo MEtoP (emulsione-polvere) microingegnerizzata, raccogliere i microgel fisicamente reticolati nel fluido ingegneristico utilizzando tubi di microcentrifuga termicamente resistenti o crioviali. Sigillare il tubo aperto con una salvietta e un nastro adesivo da laboratorio. Congelare i microgel fisicamente reticolati in azoto liquido per 10 minuti per procedere con la liofilizzazione.
Dopo la liofilizzazione, si otterrà una polvere solida. Aggiungere un millilitro di soluzione fotoiniziatore raffreddata allo 0,1% a quattro gradi Celsius alla polvere liofilizzata per produrre sospensioni di microgel. Centrifugare la miscela vortexed a 3.000 g per 15 secondi.
Dopo aver scartato il surnatante, trasferire la sospensione di microgel imballata in uno stampo utilizzando una pipetta a spostamento positivo ed esporla alla luce a una lunghezza d'onda di 400 nanometri con un'intensità di 15 milliwatt per centimetro quadrato per 60 secondi per formare scaffold granulari di idrogel o GHS. Per 400 microlitri di sospensione di microgel, aggiungere una quantità uguale di soluzione di PFO ghiacciata, il 20% in fluido ingegneristico ai microgel GelMA fisicamente reticolati. Quindi centrifugare la miscela vortexed a 300 g per 15 secondi e rimuovere la fase oleosa dai microgel GelMA mediante pipettaggio.
Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione di fotoiniziatore ghiacciato allo 0,1% alla sospensione di microgel. Dopo aver centrifugato la soluzione a vortice a 300g per 15 secondi, scartare l'olio. Ripetere i passaggi di aggiunta della soluzione fotoiniziatrice e centrifugazione, ma centrifugare a 3.000 g questa volta e scartare il surnatante dei microgel GelMA confezionati.
Trasferire i microgel GelMA confezionati in uno stampo, seguiti dall'esposizione alla luce per formare il GHS. Aggiungi 100 milligrammi di polvere di nanopiastrine a tre millilitri di acqua ultrapura ghiacciata e ghiacciata per formare una dispersione di nanoparticelle del 3,33%. Vortice la dispersione vigorosamente all'interno di un frigorifero a quattro gradi Celsius per 15 minuti per esfoliare le nanoparticelle aggregate.
Le nanoparticelle correttamente esfoliate producono una chiara dispersione. Sciogliere 50 milligrammi di LAP in cinque millilitri di acqua ghiacciata e ultrapura per preparare una soluzione madre di fotoiniziatore all'1%. Quindi aggiungere 333 microlitri di soluzione fotoiniziatrice all'1% alla dispersione di nanoparticelle esfoliate e avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce ambientale.
Vortice la miscela per un minuto per mescolare la dispersione di nanoparticelle e il fotoiniziatore. Aggiungi PFO ghiacciato, 20% in fluido tecnico ai microgel GelMA fisicamente reticolati con un rapporto di volume uno-a-uno. Dopo aver centrifugato la miscela vortexed a 300g per 15 secondi, scartare la fase oleosa contenente il tensioattivo.
Aggiungere la dispersione di nanoparticelle ghiacciata e integrata con LAP ai microgel GelMA lavati. Dopo aver centrifugato a 3.000 g per 15 secondi, scartare l'olio rimanente sul fondo e la dispersione del surnatante Conservare la sospensione a quattro gradi Celsius proteggendola dalla luce utilizzando un foglio di alluminio per un giorno per ottenere il prodotto GelMA nanoengineered granular bioink o NGB.
Il giorno seguente, caricare l'NGB in una siringa da tre millilitri. Sigillare la siringa caricata con un cappuccio e un parafilm ed eseguire una centrifugazione a impulsi a 200 g per rimuovere l'aria intrappolata. Trasferire il bioink su una cartuccia da tre millilitri utilizzando un connettore Luer femmina-femmina.
Centrifugare brevemente la cartuccia a 200 g per rimuovere l'aria intrappolata e mantenere l'NGB a quattro gradi Celsius prima dell'uso. Quindi, caricare la sospensione di cellule di fibroblasti murini preparata in una siringa da tre millilitri. Accoppiare l'NGB e le siringhe caricate a cellule utilizzando un connettore Luer femmina-femmina e mescolare delicatamente il contenuto spingendo avanti e indietro 40 volte.
Stampare l'NGB o l'NGB carico di celle utilizzando un bioprinter appropriato con un ugello conico standard caricando l'ugello nella testina di stampa da tre millilitri. Mantieni la temperatura del piano di stampa al di sotto dei 10 gradi Celsius e ottimizza parametri come velocità e contropressione. Selezionare il file gcode o STL desiderato.
Quindi selezionare il substrato e il tipo di ugello per una siringa pneumatica da tre millilitri dotata di un ugello conico standard. Calibrare la bioprinter utilizzando le linee guida del dispositivo e avviare la stampa per ottenere le strutture 3D. La tecnologia MEtoP ha prodotto polvere di microgel essiccata risospendibile mediante liofilizzazione a bassa pressione, proteggendo al contempo i microgel dall'aggregazione e dalla deformazione grave.
Le immagini SEM hanno mostrato che le microparticelle di GelMA essiccate che utilizzano questa tecnologia mantengono la loro forma sferica dopo la liofilizzazione rispetto all'aggregazione osservata con la liofilizzazione convenzionale. La caratterizzazione microporosa di GelMA, GHS e NGB con un colorante a fluorescenza ad alto peso molecolare ha mostrato gli spazi vuoti interconnessi su microscala. Inoltre, l'immagine a fluorescenza valutata utilizzando uno script MATLAB personalizzato ha rilevato i pori.
Le misurazioni della frazione di vuoto e del diametro equivalente dei pori mediani non hanno mostrato differenze significative che attestano la disponibilità e l'interconnettività dei pori su microscala negli scaffold stampati in 3D utilizzando l'NGB. La superiorità degli scaffold NGB rispetto ai microgel GelMA strettamente e liberamente imballati dalla misurazione della lunghezza del filamento appeso ha rivelato che NGB aveva una lunghezza maggiore rispetto ai microgel imballati. I microgel debolmente imballati non hanno prodotto filamenti.
Un cilindro cavo è stato stampato in 3D e l'intero costrutto è stato esposto alla luce per la fotoreticolazione. La struttura stampata è stata tenuta fisicamente per mostrare la forma, la fedeltà e l'integrità strutturale. Se l'impalcatura viene utilizzata per la valutazione biologica, ad esempio nella bioprinting carica di cellule, ricordarsi di eseguire tutti i passaggi in determinate condizioni, sotto l'armadio di sicurezza biologica.
Speriamo di de-commercializzare l'uso di scaffold granulari di idrogel come piattaforma biomateriale appena emersa in biomedicina.
