Molti canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori che si trovano ai terminali dei neuroni afferenti uditivi e vestibolari si trovano anche nei loro corpi cellulari. Le colture di corpi cellulari isolati possono essere studiate in vitro per capire come questi canali ionici e recettori influenzano le risposte dei neuroni. La morfologia compatta dei corpi cellulari consente registrazioni elettriche di alta qualità per caratterizzare le proprietà voltaggio-dipendenti dei canali ionici e dei recettori dei neurotrasmettitori.
Inoltre, il facile accesso a un'ampia varietà di tipi di cellule consente un'elevata produttività grazie all'analisi fisica della diversità cellulare. Le procedure saranno dimostrate dalla dottoranda Katherine Regalado, insieme ai borsisti post-dottorato, il dottor Daniel Bronson e Nathaniel Nowak del mio laboratorio. Per iniziare, tenere una pipetta di vetro da pascolo alla fiamma di un bruciatore Bunsen per preparare le pipette di tritrazione per la dissociazione cellulare.
Una volta che la punta del vetro inizia a sciogliersi, allungare il vetro fino al diametro desiderato. Allontanare un'estremità della pipetta dalla fiamma per creare una piccola curva. Posizionare la pipetta piegata sotto un microscopio.
Usando una piastrella di incisione, incidete e rompete il vetro al diametro desiderato. Passare la punta della pipetta sulla parte superiore della fiamma del bruciatore. Questo luciderà rapidamente i bordi ruvidi vicino alla punta.
Estrarre il cervello del topo sottoposto a eutanasia usando forbici chirurgiche chiuse. Recidere e rimuovere il nervo cranico per staccare completamente il cervello dal cranio. Partendo dalla parte posteriore della testa, stacca il materiale membranoso trasparente con una pinza, quindi taglia la parte superiore del cranio usando le forbici chirurgiche.
Rimuovere il tessuto in eccesso dalla parte posteriore della testa e del collo per rendere l'area di dissezione e la capsula otica più pulite e di più facile accesso. Trasferire il tessuto in una seconda capsula di Petri con una soluzione fresca di L-15. Quindi individuare la capsula otica e i nervi uditivi, superiore, vestibolare e vestibolare inferiore.
Separare i gangli superiori e inferiori usando piccole forbici a molla e tagliare via il nervo uditivo. Usando un bisturi, radere delicatamente la cresta ossea per indebolire l'area ossea sotto la quale il nervo si tuffa nella capsula ossea. Rimuovere con cautela i detriti con un bisturi, esponendo l'intera porzione gonfia del ganglio.
Usa le forbici a molla fine per tagliare e separare il ganglio dal ramo nervoso periferico che si sta tuffando verso l'utricolo. Rimuovere il ganglio superiore utilizzando una pinza fine e trasferirlo in una capsula di Petri da 35 millimetri con una soluzione fresca di L-15. Dopo aver preriscaldato la soluzione enzimatica, versare la miscela enzimatica in una capsula di Petri da 35 millimetri e metterla in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti.
Pulisci il ganglio usando una pinza fine e piccole forbici a molla rimuovendo l'osso, il tessuto in eccesso, le fibre nervose e qualsiasi altra struttura superflua. Fare attenzione a ridurre al minimo la rimozione di qualsiasi tessuto gangliare. Trasferire i gangli puliti nella soluzione enzimatica preriscaldata e rimetterli nell'incubatrice per 10-40 minuti.
Quindi trasferire i gangli nella capsula di Petri da 35 millimetri con una soluzione fresca di L-15. Dopo due o tre minuti, trasferire i gangli in un'altra capsula di Petri da 35 millimetri riempita con terreni di coltura filtrati. Trasferire circa 150 microlitri di terreno di coltura filtrato su un piatto con fondo in vetro rivestito.
Quindi, trasferire il numero desiderato di gangli sul vetrino coprioggetto. Prelevare una piccola quantità di terreno di coltura dal piatto di coltura e sciacquare la pipetta di tritrazione con terreno per evitare che il tessuto si attacchi ai lati della pipetta di vetro. Triturare facendo passare delicatamente e ripetutamente il tessuto attraverso la pipetta fino a quando i gangli non sono sufficientemente dissociati.
Dopo cinque minuti, controlla al microscopio se le cellule si sono depositate sul vetrino coprioggetto. Posizionare con cura un piatto di coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 12-24 ore. Successivamente, individua la capsula otica dopo aver tagliato in due la testa ed estraila dal cranio scheggiando i bordi usando una pinza.
La porzione a spirale della capsula otica ospita la coclea con l'organo di Corti. Scheggiare l'osso, sovrastante i giri cocleari con una pinza sottile parallela alla curva dell'osso. Usa piccole forbici a molla per recidere il moiolo alla base della coclea per liberarlo dal resto della capsula otica.
Tagliate l'organo di Corti in due o tre giri usando delle piccole forbici a molla in modo che sia piatto, e asportate il modiolo da ogni giro. Rimuovere la stria vascolare pizzicando la stria alla base con una pinza fine. Srotolare intorno alla spirale e fino all'apice per staccarla dall'organo di Corti.
Rimuovere il ganglio a spirale tagliando il bordo del punto in cui i tratti di fibre dei neuroni del ganglio a spirale si proiettano verso le cellule ciliate e quindi pulire il ganglio come mostrato in precedenza. Dopo aver trattato enzimaticamente il ganglio spirale, tritrare il ganglio spirale nel terreno di coltura integrato con N2 e B27. Mettere la capsula di coltura contenente i gangli dissociati in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 12-24 ore.
Immergere la punta della pipetta nella soluzione pulita del piatto di coltura per riempirlo con una soluzione pulita che non contenga amfotericina. Riempire il retro della pipetta con la soluzione interna contenente amfotericina. Immergere nuovamente la punta della pipetta nella soluzione pulita del piatto di coltura mentre l'amfotericina entra lentamente nel puntale dal retro della pipetta.
Quindi, terminare il riempimento della pipetta con la soluzione di amfotericina fino a due terzi della pipetta. Abbassare la pipetta nel bagno della camera di registrazione e posizionare il puntale della pipetta al centro del campo visivo. Assicurarsi che la punta sia priva di bolle d'aria o altri detriti.
Posizionare la pipetta vicino alla membrana e appoggiarla saldamente al centro della cella. Applicare una pressione negativa o un'aspirazione utilizzando una siringa o una pipetta per bocca. Attivare il potenziale di mantenimento di meno 60 millivolt.
La resistenza di tenuta dovrebbe aumentare fino a superare un giga ohm. Una volta formata una guarnizione giga ohm, rilasciare la pressione negativa. Prima che la tirosina inizi a funzionare, la resistenza di ingresso diminuisce lentamente e la corrente che scorre in risposta al passo di tensione di cinque millivolt, aumenta progressivamente man mano che l'amfotericina entra nella membrana.
Gli esempi rappresentativi di correnti intere cellulari evocate da un neurone gangliare vestibolare sono mostrati in questa figura. Le correnti nette di sodio verso l'interno sono qui identificate dalla loro attivazione e inattivazione transitoria. Le correnti nette verso l'esterno sono trasportate in gran parte da ioni potassio e hanno cinetiche di attivazione e inattivazione molto più lente rispetto alle correnti di sodio.
Le correnti nucleotidiche cicliche dipendenti attivate dall'iperpolarizzazione, o correnti HCN, sono attivate da una famiglia di tensioni iperpolarizzanti di lunga durata. In questa figura è mostrata la stabilità della caratterizzazione dei canali ionici nel patch perforato in diversi punti temporali durante la registrazione. Le curve di attivazione dipendenti dalla tensione delle correnti HCN sono state misurate in una configurazione a patch perforata.
La curva ha una forma sigmoidale ed è rimasta stabile per tutta la durata di una lunga registrazione. L'instabilità relativa della modalità patch rotta è illustrata da curve sigmoidali non sovrapposte da diversi punti temporali. Di seguito sono mostrate le curve di attivazione delle correnti HCN durante una configurazione patch interrotta.
Di seguito sono mostrati i modelli di attivazione in cinque gangli vestibolari somara, cinque neuroni gangliari a spirale e i corrispondenti passaggi correnti. Questa eterogeneità nei modelli di attivazione riflette una diversità fondamentale nella composizione dei canali del sodio e del potassio sottostanti sia nei neuroni gangliari vestibolari che nei neuroni gangliari spirali. Per massimizzare la sopravvivenza cellulare durante questa procedura, evitare di formare bolle d'aria, non sovraccaricare il tessuto e lasciare che le cellule si depositino prima di inserire i campioni nell'incubatrice.
Il patch clamp perforato consente lo studio dei canali ionici modulati dai secondi messaggeri citosolici, che è fondamentale per studiare gli effetti dei neurotrasmettitori efferenti sui neuroni ganglionari. Le registrazioni patch clamp di questi neuroni bipolari sono state determinanti nel rivelare come la diversità biofisica contribuisca alla diversità funzionale nei neuroni sensoriali.
