Le risposte neurali forniscono informazioni sull'attività cerebrale, ma possono variare tra esperimenti e individui. Questo protocollo aiuta automatizzando la registrazione e l'analisi della stimolazione e semplificando la programmazione di diversi tipi e modelli di stimoli. La tecnica automatizzata consente registrazioni per più neuroni e organismi nello stesso formato microfluidico in parallelo.
Ciò migliora la ripetibilità delle registrazioni e consente l'esplorazione della variabilità neuronale tra le popolazioni. Sono necessari diversi modelli di stimolazione per rivelare fenomeni neurali come l'adattamento e l'integrazione sensoriale. Questo metodo è generalizzabile ad altri segnali dinamici da cellule e organoidi a organismi e piante.
Per iniziare, accendere il microscopio, riempire e rimuovere le bolle d'aria dal tubo del serbatoio usando la siringa di adescamento, quindi riempire il tubo di deflusso con tampone. Rimuovere il dispositivo microfluidico dall'essiccatore a vuoto. Posizionare il dispositivo sul microscopio e inserire rapidamente il tubo di uscita.
Spingere delicatamente sulla siringa di uscita per iniettare fluido nel dispositivo fino a quando una goccia emerge da un ingresso. In corrispondenza di questa goccia emersa dall'ingresso, utilizzare una connessione drop-to-drop per inserire il tubo di ingresso fluidico corrispondente, assicurandosi che le gocce di liquido siano presenti sia sul tubo di ingresso che sull'oblò del dispositivo per evitare di introdurre una bolla. Collegare il tubo di ingresso successivo alla goccia successiva.
Iniettare più fluido dall'uscita, se necessario, e ripetere fino a riempire tutti gli ingressi. Inserire un perno di bloccaggio solido in corrispondenza degli ingressi inutilizzati e della porta di caricamento della vite senza fine. Controllare il flusso sullo schermo per assicurarsi che il flusso vada nella direzione desiderata.
Invertire la valvola uno sul controller della valvola e osservare il flusso di stimoli che fluisce nell'arena microfluidica. Se il flusso è sbilanciato, regolare le altezze del serbatoio. Trasferire i giovani animali adulti su un terreno di crescita di nematodi non seminato o una piastra di agar NGM usando un piccone a punta metallica, quindi inondare la piastra con circa cinque millilitri di un tampone basale XS in modo che gli animali possano nuotare.
Aspirare i vermi in una siringa di caricamento da uno a tre millilitri utilizzando il tubo collegato preriempito con un tampone basale XS. Usando uno stereoscopio, spostare il tubo sotto la superficie liquida con una mano su ciascun animale desiderato e disegnarlo nel tubo usando la siringa tenuta nell'altra mano. Chiudere il contorno della presa, rimuovere il perno di caricamento del worm e collegare la siringa di caricamento del worm al dispositivo utilizzando una connessione drop-to-drop.
Quindi far fluire delicatamente gli animali nell'arena. Stabilire il flusso tampone e attendere fino a un'ora per l'immobilizzazione mediante tetramisolo. Utilizzando l'editor di testo, creare un file di testo di definizione dello stimolo denominato userdefinedacquisitionsettings.
txt contenente le impostazioni di stimolazione per l'acquisizione automatica delle immagini. Questo file definisce i parametri di acquisizione del microscopio come i tempi di esposizione e di eccitazione, la durata della prova, gli intervalli e la directory di salvataggio. Definisce inoltre il tipo di esperimento e le impostazioni di temporizzazione della stimolazione.
Per un singolo esperimento di stimolo, utilizzare un formato con un solo comando di stimolazione ripetuto. Per un esperimento multipattern, usa un formato con più comandi di stimolazione includendo una sequenza di cifre che rappresenta l'ordine dei pattern di stimolo. Per ogni modello, inserisci un comando di stimolazione su una riga separata.
Quindi, eseguire il software di controllo del microscopio. Verifica che tutti gli ingressi fluidici siano aperti, che il flusso sia desiderato all'interno dell'arena e che i neuroni di interesse siano a fuoco all'interno della finestra live. Quindi chiudere la finestra live ed eseguire lo script multipatternrunscript.
BSH all'interno del software. Per analizzare i dati, eseguire NeuroTracker facendo clic sequenzialmente sui plugin, quindi sul monitoraggio e quindi su NeuroTracker. Selezionare la cartella contenente i file video tiff da tenere traccia e selezionare l'intervallo di file da elaborare.
Quindi, utilizzando i menu immagine e regola, apri le finestre di contrasto della luminosità e controllo soglia. Controllare lo sfondo scuro e non reimpostare l'intervallo nella finestra di soglia, impostando il metodo di soglia su predefinito e la visualizzazione su rosso. Quindi fare clic su Auto nella finestra del contrasto di luminosità per la visibilità dei neuroni.
Nella finestra di contrasto della luminosità, regolare i cursori minimo e massimo fino a quando i neuroni sono chiaramente distinguibili. Quindi regolare il livello di soglia fino a quando tutti i neuroni appaiono come piccole macchie rosse separate dagli altri oggetti. Regola il cursore del fotogramma per osservare il movimento del neurone e i cambiamenti di intensità, notando eventuali animali da escludere dal monitoraggio, ad esempio a causa della sovrapposizione con altri animali.
Dopo aver identificato i neuroni per il monitoraggio, regolare il livello di soglia per ciascun animale, se necessario, in modo tale che l'area di soglia rossa sopra il neurone sia visibile in ogni fotogramma. Fare clic sul neurone per registrare la sua posizione e il livello di soglia. Quando tutti i neuroni sono selezionati, premere la barra spaziatrice per iniziare il monitoraggio.
Monitorare il processo di tracciamento per ogni animale e apportare le correzioni necessarie. Se NeuroTracker si ferma, ha perso il neurone. Regolare il livello di soglia in base alle esigenze e fare nuovamente clic sul neurone.
Se la casella di integrazione salta a un'altra struttura animale o non neuronale vicina, premere la barra spaziatrice per mettere in pausa. Spostare nuovamente il cursore sul primo fotogramma errato e fare nuovamente clic sulla posizione corretta del neurone. Eseguire il neurotrackersummarypdf.
m in MATLAB e selezionare la cartella contenente i file di testo dei dati NeuroTracker. Attendere la generazione di un PDF di riepilogo, che consenta la verifica del processo di tracciamento. Gli animali possono essere identificati dai numeri e dalle risposte neurali di ciascun animale e sperimentazione ed essere visualizzati per valutare la variabilità della popolazione.
Utilizzare la funzione databrowse. m per esplorare i dati neurali raggruppati per numero di prova, numero di animali, modello di stimolazione o per un'altra categoria. Il fenomeno di inibizione temporale è stato testato in un esperimento di impulsi accoppiati che ha prodotto otto modelli costituiti da due impulsi odoranti di un secondo separati da un intervallo che va da zero a 20 secondi.
Il primo impulso olfattivo di un secondo ha suscitato un'entità di risposta uguale nei neuroni AWA che rilevano il diacetile e le risposte nel secondo impulso variavano con l'intervallo tra stimolo. La disinibizione è stata valutata dall'esperimento catch trial in cui è stato osservato l'adattamento allo stimolo diacetile, ma la presentazione del nuovo stimolo 2-metilpirazina non ha suscitato un forte effetto di disinibizione. La stimolazione multimodale testata ha rivelato che la stimolazione chimica da sola ha causato l'adattamento, mentre la stimolazione ottica da sola non lo ha fatto.
Tuttavia, il modello di stimolo multimodale combinato ha dimostrato che le risposte optogeniche erano suscettibili di adattamento indotto chimicamente. Modificando il design microfluidico per includere due arene, possiamo confrontare contemporaneamente le perturbazioni genetiche o di altro tipo con un riferimento corrispondente. Una volta configurato, il sistema può essere modificato in molti modi.
Ad esempio, abbiamo misurato automaticamente le risposte alla dose chimica e i cambiamenti dipendenti dallo stato dell'attività neurale, ad esempio tra gli stati di sonno e veglia.
