This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (MP).

NOTA: Un rendimenti del mouse mioblasti sufficiente per circa due piatti 35 mm o due piatti live-imaging, così stuoie piano, dissezione, e rivestimento (passo 2,6) di conseguenza. Dal momento che i mioblasti vengono isolati tramite centrifugazioni sequenziali e preplating, il protocollo dovrebbe essere fatto in lotti di 5 - 10 animali. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato etico degli animali a Instituto de Medicina Molecolare e Università Pierre et Marie Curie 1. La dissezione dei neonatale Mice muscoli posteriori degli arti <ol><li> Preparare tutte le soluzioni in anticipo (Materials Table) e sterilizzare per filtrazione (0,22 micron filtro). Assicurarsi che tutti i mezzi sono a 37 ° C prima dell&#39;aggiunta alle celle, tranne le formulazioni contenenti matrice membrana basale (ad esempio, Matrigel). </li><li> Sterilizzare il materiale dissezione (uno ciascuno di: forbici curve, forbici, pinze diritte regolari,e pinze fine-tip) e il banco di lavoro pulendo con il 70% di etanolo. </li><li> Preparare da 100 mm capsula di Petri con 5 ml di Dulbecco tampone fosfato (DPBS) per la raccolta dei muscoli e tenerlo in ghiaccio fino al passo macinazione. </li><li> Decapitare P6 - P8 topi con le forbici diritte e sterilizzare la pelle con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un&#39;incisione nella pelle indietro e tirare delicatamente verso gli arti posteriori fino a quando non viene rimosso, esponendo completamente la muscolatura degli arti posteriori. </li><li> Utilizzare le pinze per rimuovere il tessuto grasso senza danneggiare i muscoli. </li><li> Per rimuovere le dorsali muscoli posteriori degli arti, tenere l&#39;arto allungato e piegare la zampa per esporre i tendini del tallone. Utilizzare le forbici curve al muscolo separata dall&#39;osso, partendo dai tendini, facendo scorrere verso l&#39;alto e tagliando delicatamente. Accise L&#39;muscoli e metterli in DPBS ghiacciate. </li><li> Isolare il quadricipite pizzicando il muscolo con una pinza fine-tip e il taglio intorno ad esso senza danneggiare il femore o del ginocchio.</li><li> Dopo la dissezione tutti gli animali, procedere ad una cappa di coltura cellulare a flusso laminare sterile, dove devono essere eseguiti i seguenti passaggi. </li></ol> Isolamento 2. Myoblast <ol><li> Rimuovere l&#39;eccesso di DPBS. Macinare il tessuto con forbici curve sterilizzati in modo da ottenere una massa uniforme. </li><li> Raccogliere il tessuto macinate in una provetta da centrifuga da 50 ml conica con 5 ml di miscela di digestione e incubare con agitazione a 37 ° C per 90 min. </li><li> Arrestare la digestione aggiungendo 6 mL di media dissezione e centrifugare la sospensione per 5 min a 75 xg per sedimentare il tessuto rimanente. </li><li> Raccogliere accuratamente il surnatante. Assicurarsi di non raccogliere i detriti dei tessuti. Centrifugare a 350 xg per 5 min; risospendere in 5 mL di media dissezione. </li><li> Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 40 micron. Aggiungere 25 ml di mezzo dissezione e preplate in un piatto di 150 mm per 4 h in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2 &lt;/ Sub&gt;) per consentire ai fibroblasti di aderire. </li><li> Mentre preplating, piatti cappotto con 500 ml di matrice membrana basale diluito 1: 100 in IMDM fredda per 1 ora a RT. Lavare una volta con DPBS e piastra immediatamente le cellule (passo 2.8) o lasciare con terreno di coltura fino placcatura. </li><li> Dopo preplating, raccogliere il surnatante e centrifugare a 350 xg per 10 min. </li><li> Risospendere in mezzo di crescita e contare le cellule su un emocitometro. Regolare il volume in modo che tra 150.000 e 250.000 cellule sono placcati per membrana basale piatto matrice rivestite. Mantenere le cellule in un incubatore di coltura cellulare. </li></ol> 3. Differenziazione myofiber NOTA: Dopo 3 d, le cellule devono iniziare a fondere e formare miotubi intorno al 70% di confluenza (Figura 1B). <ol><li> A questo punto, trasfezione delle cellule, se desiderato, con un siRNA o DNA di interesse. Se le cellule non devono essere transfettate, modificare direttamente al terreno di differenziamento e scip al passo 3.4. </li><li> Trasfezione con i reagenti di trasfezione seguito le istruzioni del produttore. Incubare le cellule per 5 h con complessi siRNA-lipidi (20 Nm + 1 ml di reattivo) o complessi DNA-lipidi (1 mg + 1 ml di reagente). Ottimizzare le concentrazioni di siRNA e di DNA, se necessario. </li><li> Lavare una volta con mezzo di differenziazione e quindi passare al nuovo mezzo di differenziazione. </li><li> Il giorno seguente, diluire la matrice membrana basale 1: 2 in terreno di differenziamento ghiacciata. Rimuovere il supporto esistente e aggiungere 200 ml di matrice ghiacciata per ogni piatto. </li><li> Incubare per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare. </li><li> Supplemento del mezzo di differenziazione con agrina (100 ng / mL) e aggiungere con cautela 2 ml per le cellule. </li><li> Cambiare con cura la metà del mezzo ogni 2 d, sempre che completa con agrina ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. </li><li> Monitorare la differenziazione cellulare e la vitalità. A seconda di una varietà di fattori (come FBS ecHicken embrione origini estratto), le cellule potrebbe richiedere tra i 5 - 10 differenziazione d per raggiungere la piena maturazione (Figura 2). </li></ol> 4. Immunocolorazione in piatti con fondo di vetro <ol><li> Per immunostaining, in qualsiasi momento, di interesse, lavare le cellule una volta con DPBS e fissarle con 4% PFA a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare due volte con DPBS. A questo punto, le cellule possono essere conservati a 4 ° C. </li><li> li permeabilize con 0,5% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare due volte con PBS e bloccare con soluzione bloccante per 30 minuti a RT. </li><li> incubare con l&#39;anticorpo primario diluito in soluzione bloccante O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare 3x con DPBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> li Incubare con l&#39;anticorpo secondario e 0,2 mg / ml di DAPI per 1 ora a RT. </li><li> Lavare 3x con DPBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 200 ml di mezzo di montaggio e procedere a delle immagini. </li></ol>

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	<li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr.">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).</li><li>Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+excitation-contraction+coupling+related+genes+reveal+aspects+of+muscle+weakness+beyond+atrophy-new+hopes+for+treatment+of+musculoskeletal+diseases.">Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases.</a> Front Physiol. 5, 37 (2014).</li><li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle.">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li><li>Pasut, A., Jones, A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dihydropyridine+receptor+alpha+subunits+in+normal+and+dysgenic+muscle+in+vitro:+expression+of+alpha+1+is+required+for+proper+targeting+and+distribution+of+alpha+2.">Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2.</a> J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).</li><li>Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2C12+co-culture+on+a+fibroblast+substratum+enables+sustained+survival+of+contractile,+highly+differentiated+myotubes+with+peripheral+nuclei+and+adult+fast+myosin+expression.">C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).</li><li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases.">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skelet Muscle. 1, 26 (2011).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+study+mechanisms+of+neuromuscular+junction+development+and+maintenance.">A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance.</a> Development. , (2016).</li><li>Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+disruption+perturbs+post-synaptic+components+and+contributes+to+impaired+MuSK+clustering+at+the+NMJ:+implication+in+ALS.">Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS.</a> Sci Rep. 6, 27804 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;uso di questo protocollo per la coltivazione di mioblasti primari dà luogo ad una nicchia speciale che alimenta notevolmente lo sviluppo delle miofibre. Questo è parzialmente dovuto ad altri tipi di cellule che sono presenti in numero limitato anche. Un equilibrio tra la concentrazione dei mioblasti e cultura purezza deve essere raggiunto. Una cultura buona cellulare dipende anche dalla qualità dei prodotti utilizzati per la formulazione di media. Tutti i prodotti derivati ​​da fonti animali devono essere accuratamente testati. Nella nostra esperienza, le condizioni di digestione devono essere monitorati. Come di consueto per colture primarie, la variabilità sperimentale può essere superiore negli studi con fibre isolate o mioblasti immortalati. Questa variabilità può essere ridotta dalla standardizzazione dei media e di digestione componenti, topi età e dimensioni, ed i punti di tempo per la manipolazione della cultura e la raccolta dei risultati. Tuttavia, il vantaggio di scrutare in tempo reale complessi meccanisminecessario per lo sviluppo myofiber supera notevolmente l&#39;inconveniente variabilità. Questo protocollo conferisce i vantaggi di vitro approcci senza compromettere la differenziazione cellulare. Miofibre maturano fino triadi sono formate e contrazioni sono accoppiati a scintille calcio. Queste uscite funzionali sono accessibili in diverse condizioni sperimentali. Inoltre, ci possono essere molte varianti tecniche apportate al protocollo. Mioblasti possono essere raccolte da topi neonati con mutazioni di interesse relative allo sviluppo muscolare. Le celle possono essere lisate per l&#39;analisi biochimica in diversi momenti differenziazione. indicatori di calcio possono essere aggiunti alla coltura di seguire le dinamiche. costrutti optogenetic possono essere utilizzati per far rispettare determinate vie di segnalazione o per indurre specifiche risposte locali. Infine, le fibre muscolari possono essere messi in coltura con i tipi di altre cellule per studiare le loro interazioni.

Il muscolo scheletrico compone fino al 40% del peso del corpo umano 1. Disturbi muscolari associate rappresentano un immenso salute e l&#39;onere economico 2. Come questo tessuto altamente complessa e organizzata si forma, la manutenzione e rigenerato costituisce un campo di ricerca estesa e consolidata. A seconda del particolare interesse scientifico, l&#39;approccio più adatto può variare da semplici culture myotube a complessi modelli in vivo 3 - 6. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un sistema in vitro che consente il monitoraggio della miogenesi mediante imaging vivo e immunofluorescenza. Rispetto ai metodi tradizionali, questo sistema offre una visione molto completa e dinamica nel processo miogenico mouse. Le cellule possono essere seguiti dalla fase mioblasti al maturo, myofiber multinucleate visualizzazione triadi trasversali e dei nuclei periferici 7. Questo livello di maturazione puòrealizzabile con attrezzature regolare coltura cellulare, senza bisogno di apparati stimolatorie o meccanici complessi. Anche se alcuni di successo nei sistemi in vitro sono stati segnalati 8,9, a nostra conoscenza, questo è l&#39;unico protocollo che genera miofibre mature del mouse con T-tubuli trasversalmente in coppia con reticolo sarcoplasmatico (SR). Così, questo sistema in vitro può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari di formazione triade, che sono ancora poco conosciuti 10. Un ulteriore vantaggio di questo sistema è la disponibilità di risorse topo targeting convalidati, come gli anticorpi, farmaci e strumenti RNAi. Il protocollo relativamente semplice non richiede operazioni laboriose, manipolazione altamente qualificato, o attrezzature costose e dedicato. Miofibre maturate iniziano ad apparire dopo 5 d della cultura differenziazione 7, la visualizzazione di contrattilità accoppiato con scintille di calcio (dati non pubblicati). In una settimana, il diverso sviluppoAl fasi di una delle celle più complesse nel corpo dei mammiferi possono essere studiati in combinazione con una varietà di saggi in vitro.

<table><tbody><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase&amp;nbsp;type V</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>C9263</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Glutamax supplemented</td><td>Gibco</td><td>31980022</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth reduced factor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be &amp;lt;1.5</td></tr><tr><td>Chicken Embryo Extract</td><td>MP biomedical</td><td>2850145</td><td>it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))</td></tr><tr><td>Recombinant rat agrin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>550-AG-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>11581831</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>used to transfect siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX</td><td>Invitrogen</td><td>15338-100</td><td>used to transfect DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668030</td><td>used to transfect siRNA plus DNA</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>Corning</td><td>21008-949</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td>dishes used to cultivate cells for live imaging</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA (Paraformaldehyde)</td><td>Science Services GmbH</td><td>E15710</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>use at 200 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions and Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Mix</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 5 mg/mL collagenase&lt;br/&gt; 3.5 mg/mL dispase&lt;br/&gt; sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dissection Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 10% FBS&lt;br/&gt; 1% Penicillin/Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Growth Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 20% FBS&lt;br/&gt; 1% Chicken Embryo Extract&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Differentiation Medium</td><td></td><td></td><td>in IMDM Glutamax supplemented&lt;br/&gt; 2% Horse Serum&lt;br/&gt; 1% Penicillin-Streptomycin&lt;br/&gt; sterile filtered</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>in DPBS&lt;br/&gt; 10% Goat Serum&lt;br/&gt; 5% BSA&lt;br/&gt; add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of mature myofibers for live imaging

I muscoli scheletrici sono composte da fibre muscolari, i più grandi cellule nel corpo dei mammiferi e uno dei pochi sincizi. Come le strutture complesse e evolutivamente conservati che lo compongono sono assemblati resta sotto osservazione. Le loro dimensioni e caratteristiche fisiologiche spesso limitano le applicazioni di manipolazione e di imaging. La cultura di linee cellulari immortalizzate è ampiamente utilizzato, ma può replicare solo le prime fasi di differenziazione. Qui, descriviamo un protocollo che consente una facile manipolazione genetica delle fibre muscolari provenienti da mioblasti di topo primari. Dopo una settimana di differenziazione, le miofibre mostrano contrattilità, allineati sarcomeri e triadi, così come nuclei periferici. L&#39;intero processo di differenziazione può essere seguita da imaging dal vivo o immunofluorescenza. Questo sistema combina i vantaggi della esistente ex vivo e in vitro protocolli. La possibilità di facile ed efficiente trasfezione nonchéla facilità di accesso a tutti gli stadi di differenziazione amplia le potenziali applicazioni. Miofibre può successivamente essere utilizzato non solo per affrontare importanti questioni di biologia dello sviluppo e delle cellule, ma anche di riprodurre fenotipi malattia muscolare per le applicazioni cliniche.

Il grado di sviluppo myofiber è in gran parte determinato dalla purezza e vitalità dei mioblasti isolati. L&#39;adesione, proliferazione, e la capacità di fusione possono essere utilizzati per accedere empiricamente quei parametri (Figura 1 A, B). A proliferazione D2, mioblasti dovrebbero hanno aderito e dovrebbe visualizzare la tipica forma fusiforme. Proliferazione dovrebbe accadere estesamente in questa fase, che porta alla formazione myotube spontanea il giorno successivo (Figura 1B). Cellulare confluenza potrebbe aver bisogno di piccoli aggiustamenti. Dovrebbe essere aumentato se mioblasti prendere più di 3 d di proliferare e fusibile. Dovrebbe essere diminuita se miofibre non possono crescere e allungare relativamente semplice a causa della loro densità. Confluenza tipicamente diminuisce dal centro alla periferia del piatto, in modo che i migliori miofibre dovrebbero trovare verso le regioni esterne. Miotubi si allungano in modo rapido e visualizzare più nuclei allineati in posizione centrale (Figura 1C). Con D5, alcune cellule iniziano l&#39;acquisizione di striature e trasferire i loro nuclei verso la periferia. Il numero di miofibre con caratteristiche maturi aumenta con il tempo e con spessore di cellule (Figura 1D). Il grado di differenziazione può essere ulteriormente osservato mediante immunofluorescenza. Miofibre fissati differenziazione D8 triadi presenti trasversali. Questo può essere confermato da componenti di imaging del T-tubuli (DPHR) e SR (triadina), che dovrebbero colocalize le triadi (Figura 2). La funzionalità di miofibre può essere affrontato da immagini dal vivo. Da differenziazione D3 in poi, le cellule mostrano contrazioni spontanee. Trasfettando un sensore di calcio (ad esempio., GCaMP6f 11), è possibile osservare che le contrazioni sono accoppiati con picchi di calcio (Figura 3). Utilizzando questo sistema, siamo stati in grado di identificare un percorso molecolare romanzo che viene interrotto in miopatie centronucleare e distrofie miotoniche, che possono quindi essere un obiettivo nuovo per terapie molecolari innovative 7. Abbiamo anche adattato questo metodo per studiare lo sviluppo della giunzione neuromuscolare (NMJ) 12. Attraverso la co-coltura con il ratto espianti midollo spinale, abbiamo descritto un ruolo per dynein nella formazione NMJ 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig1.jpg" /> Figura 1: fasi di sviluppo della cultura mioblasti. A) A proliferazione D2, mioblasti hanno aderito e iniziato a proliferare. B) A prolifperazione D3, una confluenza di 60 - 80% è raggiunto, e mioblasti avviare fusione spontaneamente. C) A differenziazione D3, miotubi contenenti nuclei centrali sono predominanti. D) Da differenziazione D5 in poi (ad esempio, il giorno 8), miofibre iniziare esibendo striature e nuclei periferici e cominciano ad addensarsi. barra della scala: 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig2.jpg" /> Figura 2: Rappresentante confocale immagine di una D8 myofiber Immunostain. A) immunocolorazione per il recettore diidropiridina (DHPR, pannello superiore) e triadina (TRDN, pannello centrale). Una sovrapposizione dei canali DHPR, TRDN, e DAPI mostra colocalization dei componenti della triade. B)<html> Un profilo di intensità della linea gialla disegnato in A. C) Una immagine 3D di rendering volumetrico di miofibre colorate per α-actinina (verde) e DAPI (blu). Scala bar e griglia di larghezza: 5 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55141/55141fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55141/55141fig3.jpg" /> Figura 3: immagini dal vivo dei livelli di calcio in miofibre con spontanea spasmi. A) time-lapse ad alta velocità (20 ms fotogrammi) microscopia di una scintilla di calcio in un myofiber spasmi. Il calcio è stato rilevato attraverso l&#39;espressione di GCaMP6f (Addgene plasmide # 40755). B) Quantificazione dell&#39;intensità di fluorescenza nel tempo per il sensore calcio nel pannello A._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

10.2K Views.  Universidade de Lisboa. Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for muscle regeneration. Upon injury, which occurs frequently in skeletal muscles, SCs are activated. They proliferate as myoblasts and differentiate to repair muscle lesions. Among many events that take place during muscle differentiation, cytosolic Ca2+ signals are of great importance. These Ca2+ signals arise from Ca2+ release from internal Ca2+ stores, as well as from Ca2+ entry from the extracellular space, particularly the store-operated Ca2+ entry (SOCE). This paper describes a methodology used to obtain a pure population of human myoblasts from muscle samples collected after orthopedic surgery. The tissue is mechanically and enzymatically digested, and the cells are amplified and then sorted by flow cytometry according to the presence of specific membrane markers. Once obtained, human myoblasts are expanded and committed to differentiate by removing growth factors from the culture medium. The expression levels of specific transcription factors and in vitro immunofluorescence are used to assess the myogenic differentiation process in control conditions and after silencing proteins involved in Ca2+ signaling. Finally, we detail the use of Fura-2 as a ratiometric Ca2+ probe that provides reliable and reproducible measurements of SOCE.

Here, we describe a methodology to obtain a pure population of human myoblasts from adult muscle tissue. These cells are used to study in vitro skeletal muscle differentiation and, in particular, to study proteins involved in Ca2+ signaling.

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Genetica

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Biologia

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Medicina

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Misurazioni contrattili ad alta produttività di fibre muscolari di topo intatte incorporate in idrogel utilizzando un sistema basato sull'ottica

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell'entrata del calcio a livello di deposito

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Misurazioni contrattili ad alta produttività di fibre muscolari di topo intatte incorporate in idrogel utilizzando un sistema basato sull'ottica

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Riepilogo

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Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell'entrata del calcio a livello di deposito

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Sfruttando Live Imaging ai Nuclei di pista durante il differenziamento dei mioblasti e Fusion

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Misurazioni contrattili ad alta produttività di fibre muscolari di topo intatte incorporate in idrogel utilizzando un sistema basato sull'ottica

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling