Il protocollo presentato è un metodo altamente flessibile per la manipolazione del genoma nell'ovidotto del topo. Permette la formazione di cellule mutate sporadicamente circondate da cellule inedite all'interno di un ambiente immunocompetente. Questo è vantaggioso per studiare l'iniziazione del cancro.
Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua elevata adattabilità nel colpire un organo, un'area, una regione o un tipo di cellula di interesse con set facilmente intercambiabili di combinazioni di mutazioni, il tutto senza l'assoluta necessità di una linea di topo. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'uso in organi con il lume e parenchima d'organo. Per iniziare, tirare un tubo capillare di vetro in una punta acuminata usando un estrattore di micropipette.
Utilizzando un paio di pinze affusolate a punta ultra fine, tagliare l'estremità appuntita del tubo capillare tirato sotto un microscopio da dissezione per creare un'apertura. Assicurarsi che l'apertura non sia troppo grande, in quanto danneggerà l'ovidotto e impedirà l'iniezione lenta. Quindi, disporre l'attrezzatura chirurgica sterile, il microscopio, il micromanipolatore e l'elettroporatore su un banco pulito e sterile o all'interno dell'armadio di biosicurezza.
Riscaldare il termoforo su un disco e posizionarlo sotto una gabbia pulita e completamente attrezzata. Versare 1X PBS sterile in una capsula di Petri. Usando un paio di forbici pulite, tagliare la carta assorbente in quadrati uno per un centimetro.
Lasciali cadere in PBS per immergerli. Quindi, collegare l'ago capillare tirato al micromanipolatore a morsetto, stabilizzato da un supporto magnetico. Pipettare due microlitri della soluzione iniettabile su una capsula di Petri sterile.
Durante l'osservazione al microscopio, prelevare lentamente da uno a due microlitri della soluzione di iniezione nell'ago di microiniezione utilizzando la siringa ad aria compressa collegata al micromanipolatore. Evitare di prendere bolle nell'ago. Dopo aver anestetizzato un topo femmina di sei-otto settimane e somministrato carprofen per via sottocutanea, posizionare il topo sulla carta assorbente riscaldata con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
Applicare lubrificante per gli occhi su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione durante l'intervento chirurgico. Dopo aver confermato l'arresto anestetico pizzicando la punta con un paio di pinze, rimuovere la pelliccia dorsale attorno al sito di incisione prospettica e pulire la pelle nuda con antisettico. Usa un paio di pinze dritte e smussate per pizzicare la pelle nuda e creare un'incisione lunga un centimetro lungo la linea mediana del corpo usando un paio di forbici sterili.
Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili Adson. Quindi, utilizzando un paio di pinze sterili, curve e seghettate, separare delicatamente la pelle dalla parete del corpo, iniziando dall'incisione della linea mediana e spostandosi lateralmente. Dopo aver individuato il cuscinetto di grasso sotto il rene, utilizzare un paio di pinze sterili, dritte e smussate per pizzicare la parete del corpo direttamente sopra il cuscinetto adiposo.
Crea una piccola incisione nella parete del corpo usando un paio di forbici da dissezione sterili, affilate e appuntite, facendo attenzione ad evitare i vasi sanguigni. Mentre si pizzica ancora la parete del corpo con una pinza dritta, smussata, inserire un paio di pinze sterili, smussate e curve nell'incisione e allargare l'incisione creata nella parete del corpo. Prendi il cuscinetto di grasso visibile con la pinza smussata e curva e tiralo fuori dal foro per esporre l'ovaio, l'ovidotto e l'utero.
Mantenere la traccia riproduttiva esposta bloccando il cuscinetto di grasso con un morsetto sterile per bulldog. Posizionare con attenzione il topo anestetizzato con la traccia riproduttiva esposta sul palco di un microscopio da dissezione. Regolare il micromanipolatore in modo tale che l'ago per iniezione con la soluzione sia osservato al microscopio.
Quindi manipolare il microscopio per osservare facilmente l'ovaio, l'ovidotto e l'utero. Utilizzando un paio di pinze sterili, affusolate, a punta ultra fine, tenere la regione dell'ovidotto da iniettare. La regione deve allinearsi con la direzione dell'ago di microiniezione.
Regolare il micromanipolatore per perforare l'ovidotto con l'ago per microiniezione, alimentando contemporaneamente l'ovidotto sull'ago utilizzando la pinza affusolata a punta ultra fine. Spostare delicatamente l'ago per microiniezione per confermare che è stato inserito nell'ovidotto. Iniettare lentamente un microlitro della soluzione di iniezione e il blu di tripano filtrato al 5% nell'ovidotto, osservando il movimento della soluzione blu e l'espansione del lume dell'ovidotto.
Evitare di introdurre bolle nel lume. Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dall'ovidotto e coprire l'area da prendere di mira con un pezzo di carta assorbente pre-imbevuto di PBS. Afferrare la carta pre-imbevuta e l'area da colpire con un paio di pinzette per elettrodi e allontanare dal corpo.
Elettroporare la regione target utilizzando tre impulsi unipolari a 30 volt per 50 millisecondi con intervalli di un secondo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere la carta assorbente e riposizionare il mouse sul termoforo. Sblocca il morsetto del bulldog e spingi con attenzione la traccia riproduttiva esposta sotto la parete del corpo.
Dopo che entrambi gli ovidotti sono stati elettroporati e riposti sotto la parete del corpo, utilizzare un portaaghi per afferrare l'ago. Pizzicare e tenere premuto un lato del sito di taglio usando un paio di pinze sterili, curve e seghettate. Quindi, utilizzare il supporto dell'ago per manipolare la sutura e chiudere la ferita.
Spostare il mouse in una gabbia pulita posizionata sopra una piastra elettrica e monitorare fino a quando il mouse è attivo. Dopo l'elettroporazione con elettrodi di tipo pinzetta da tre o un millimetro, l'area mirata etichettata con TdTomato è stata limitata all'epitelio dell'ovidotto distale. Con elettrodi di tipo pinzetta da tre millimetri, un'area molto più ampia delle ampolle è stata presa di mira rispetto al targeting solo della punta più distale, l'infundibulum, utilizzando elettrodi di tipo pinzetta da un millimetro.
Nella regione mirata, le cellule elettroporate contrassegnate da TdTomato sono state distribuite in modo casuale tra le cellule non elettroporate. Inoltre, le cellule elettroporate erano limitate all'epitelio della mucosa e non osservate nello strato stromale o muscolare sottostante. Per confermare l'editing del genoma mediato da CRISPR, la cellula fluorescente può essere isolata mediante ordinamento FACS per l'isolamento e il sequenziamento del DNA.
Questo ci permette di quantificare la frequenza degli alleli mirati traccia le comunicazioni uniche tra campione per seguire l'evoluzione coronale in vivo del tumore primario e metastasi in ambiente immunocompetente.
