Abbiamo sviluppato un protocollo rapido ed efficiente per generare organoidi del cancro della vescica tramite editing genetico ex vivo di normali cellule uroteliali di topo che trasportano alleli flossi in geni di interesse. Questo metodo ex vivo ha un flusso di lavoro da una a due settimane invece di anni di allevamento di topi ed è altamente efficiente nella trasduzione dell'adenovirus sulle delezioni geniche mediate da Cre. Per iniziare, preparare tutti gli strumenti e i reagenti sterili, tra cui forbici, pinze, DPBS in piatti di coltura da 35 millilitri, etanolo al 70%, garze e asciugamani di carta puliti.
Quindi, pulire tutte le superfici dell'area di dissezione e coprire l'area di dissezione con un tovagliolo di carta pulito. Posizionare il topo eutanasizzato sulla garza nell'area di dissezione e spruzzare il 70% di etanolo sull'addome del topo, quindi utilizzando forbici di dissezione sterili, eseguire un'incisione addominale della linea mediana inferiore per esporre la vescica. Ora, usa la pinza per afferrare e tirare delicatamente su la vescica per identificare la giunzione ureterovesica bilaterale.
Usando le forbici, rimuovere il fondo della vescica, seguendo la linea di confine tra le due aperture dell'uretere e trasferire la vescica in un piatto sterile contenente 2 millilitri di DPBS, quindi rimuovere il tessuto adiposo e connettivo e mettere la vescica in un nuovo piatto contenente 2 millilitri di DPBS. Rimuovere anche l'adenovirus dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius e tenerlo sul ghiaccio. Per la dissociazione cellulare, preparare tutti gli strumenti e i reagenti sterili come descritto nel manoscritto, quindi in un armadio di biosicurezza, trasferire la vescica in un piatto da 35 millimetri e lavare con 2 millilitri di DPBS sterile.
Raccogli i tessuti della vescica da quattro topi in un piatto con un millilitro di terreno di coltura completo senza FBS spogliato di carbone. Successivamente, usando una lama chirurgica, tritare ogni vescica in quattro pezzi uguali, quindi usando una pinza, aprire la vescica per esporre la superficie dell'urotelio al mezzo. Trasferire i pezzi della vescica e il mezzo in un tubo centrifugo da 15 millilitri.
Lavare il piatto due volte con 2 millilitri di terreno di coltura completo senza FBS spogliato di carbone e aggiungere il lavaggio al tubo della centrifuga, portando il volume totale a 5 millilitri. Quindi, aggiungere una miscela di collagenasi e ialuronidasi e posizionare il tubo orizzontalmente in un incubatore di shaker orbitale a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 200 RPM. Dopo la digestione dei tessuti, aggiungere un volume uguale di FBS e DPBS al 10% di carbone nel tubo e centrifugare a 200 volte g per 5 minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 2 millilitri di sostituto della tripsina nel pellet cellulare e mescolare bene, quindi incubare il tubo a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 4 minuti. Dopo l'incubazione, pipettare le celle su e giù 10 volte con una punta P1000 standard e aggiungere 5 millilitri di FBS e DPBS al 10% di carbone di legna. Filtrare le cellule dissociate attraverso un filtro a cellule sterili da 100 micrometri e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri.
Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospesciare il pellet in 1 millilitro di terreno di coltura completo. Contare il numero di cellule usando un emocitometro e una piastra da 0,5 volte 10 alla sesta cella in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco completo.
Quindi, estrarre gli estratti di matrice delle cellule di sarcoma del topo Engelbreth-Holm-Swarm da meno 20 gradi Celsius e scongelarli sul ghiaccio. Inoltre, prima della guerra una piastra a 6 pozzetti in un incubatore di celle a 37 gradi Celsius. Per la trasduzione adenovirale, aggiungere 2 microlitri di adenovirus nella piastra a 24 pozzetti e mescolare bene con le cellule uroteliali dissociate.
Per migliorare l'efficacia della trasduzione, eseguire la spinoculazione centrifugando la piastra a 300 volte g per 30 minuti, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 1 ora. Trasferire le cellule e il mezzo dal pozzo in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per 5 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 50 microlitri di terreno di coltura completo e mescolare bene con le cellule nella parte inferiore.
Quindi, aggiungere 140 microlitri di estratto di matrice e mescolare delicatamente bene per evitare bolle d'aria, quindi creare cupole per organoidi aggiungendo rapidamente 50 microlitri della soluzione per cupola nella piastra a 6 pozzetti preribalizzata. Incubare la piastra e lasciare che le cupole si solidifichino per 5 minuti. Dopo 5 minuti, capovolgere la piastra a 6 pozzetti e continuare la solidificazione per altri 25 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 2,5 millilitri di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore per la coltura organoide. La proteina fluorescente verde è stata rilevata in quasi il 100% delle cellule, suggerendo un'elevata efficienza di trasduzione dell'adenovirus. La colorazione di ematossilina ed eosina e l'immunoistochimica dei tumori organoidi a tripla knockout hanno mostrato la morfologia del carcinoma uroteliale di alto grado con espressione proteica positiva dei marcatori basali del sottotipo di CK5 e p63.
Gli alleli floxed non ricombinati sono stati rilevati in cellule uroteliali, non trattate con adenovirus, mentre gli alleli ricombinati sono stati osservati negli organoidi a triplo knockout. In generale, sono state necessarie da 2 a 3 settimane per formare un tumore sottocutaneo di 2 centimetri. L'immunoistochimica degli organoidi a triplo knockout, xenotrapianti in vivo, ha mostrato un'espressione positiva delle proteine CK7, CK5 e p63.
È stata rilevata un'espressione negativa per le proteine CK8 e uroplakin. Il marcatore mesenchima, vimentina, è stato rilevato solo nella capsula tumorale o stroma. La dissociazione della vescica del topo non deve superare i 30 minuti.
Un tempo di dissociazione più lungo può aumentare nella percentuale delle cellule stromali, come le cellule endoteliali e i fibroblasti Questo approccio può essere combinato con lo smistamento cellulare o il tipo cellulare di un adenovirus specifico per generare il tipo cellulare di organoidi specifici, come il lume rispetto agli organoidi basali.
