La cyber generation è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del DNA mitocondriale e per correlare la percentuale di atriplasmia con la gravità della malattia. Questa tecnica consente di eseguire indagini biochimiche in un sistema nucleare omogeneo, in cui è assente il contributo del background nucleare del paziente. Questa tecnica consente di convalidare la patogenicità di una mutazione del DNA mitocondriale.
e permette di studiarne l'impatto a livello biochimico Lavare due volte le piastre da 35 millimetri contenenti i fibroblasti utilizzando due millilitri di 1X PBS senza calcio e magnesio. Pulire la superficie esterna dei piatti con etanolo al 70% e attendere che l'alcol evapori. Rimuovere i coperchi dai piatti e i tappi a vite dalle bottiglie.
Posizionare ogni piatto senza coperchio capovolto sul fondo di ogni flacone di centrifuga da 250 millilitri. Aggiungere lentamente 32 millilitri di un mezzo di nucleazione a ciascuna bottiglia permettendo al mezzo di entrare nel piatto e di entrare in contatto con le cellule. Rimuovere eventuali bolle dai piatti usando una lunga pipetta di pascolo di vetro, curvando la punta in una fiamma bunsen.
Chiudere ogni flacone con il tappo a vite e trasferirle nella centrifuga. Centrifugare per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 8.000 x G.Aspirare il mezzo dalle bottiglie e scartarlo. Rimuovere i piatti invertendo le bottiglie su una garza sterile precedentemente spruzzata con etanolo al 70%.
Pulire la superficie esterna dei piatti e i loro coperchi con il 70% di etanolo e chiudere i piatti dopo che l'etanolo è evaporato. Prima di procedere controllare la formazione di citoplasti utilizzando un microscopio invertito per cellule vive. Cerca fibroblasti estremamente allungati a causa dell'estrusione dei loro nuclei indotta dalla citocalasina.
Ad ogni piatto da 35 millimetri aggiungere 1.000, 143 celle zero riga. Ri-sospeso in due millilitri di terreno di coltura integrato con il 5% FBS. Lasciare i piatti per tre ore in un incubatore di anidride carbonica umidificata per sistemare le 143 celle zero file sui fantasmi.
Dopo tre ore di incubazione, aspirare e scartare il mezzo. Lavare le cellule di aderenza due volte con due millilitri di mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM senza siero o MEM, quindi aspirare e scartare il mezzo. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di polietilenglicole alle cellule e incubare per esattamente un minuto.
Aspirare ed eliminare la soluzione di polietilenglicole. Lavare le cellule tre volte con due millilitri di DMEM ad alto glucosio senza siero o con MEM. Aggiungere due millilitri di mezzo di fusione e incubare durante la notte nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Tripsinizzare le cellule nei restanti piatti di coltura Contarle e seminarle in una o più piastre di Petri Aggiungi da 50 a 100 cellule per piatto nella coltura integrata fino a quando non compaiono i cloni. Quindi lasciali crescere per diversi giorni. Usando uno stereomicroscopio, raccogli i cloni dalla capsula di Petri con cilindri di clonazione o una punta di pipetta.
Cerca di evitare di raggruppare diversi cloni e trasferirli in una piastra da 96 pozzi, ciascuno contenente 200 microlitri di terreno di coltura integrato. I cibridi sono stati generati a partire da fibroblasti derivati da un paziente portatore dell'eteroplasmatico M2343A2G Una delle più comuni mutazioni del DNA mitocondriale associate a miopatia mitocondriale, acidosi lattica da encefalopatia ed episodi simili a ictus. L'analisi di un numero variabile di ripetizioni in tandem ha mostrato che il DNA informatico è identico alle cellule della riga zero confermando la sostituzione del DNA informatico del paziente con il genoma 143 B.
Il polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione, o analisi di sequenziamento, può essere utilizzato per valutare la presenza della mutazione del DNA mitocondriale e la percentuale di eteroplasmia. Quando si tenta questo protocollo è importante verificare il corretto patrimonio genetico del NUCLEONE e del DNA mitocondriale, nonché la quantità di DNA mitocondriale nei cibridi ripopolati.
