Proponiamo una nuova piattaforma per indagare gli effetti della forma cellulare sull'espressione genica, utilizzando metodi per coltivare e smistare aderenze con morfologie diverse a livello di singola cellula. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita lo studio ad alta produttività della forma cellulare in vitro poiché confrontare cellule con forme diverse in vivo è tecnicamente impegnativo. Per impostare una coltura di cardiomiociti modellata, trasferire una sospensione cardiomiocitaria alle proporzioni di interesse a un tubo da 15 millilitri per contare e diluire le cellule a una volta 10 alle cinque cellule per millilitro di concentrazione media di placcatura appropriata.
Aggiungere due millilitri di cellule su un chip micropatterned rivestito di fibronectina immerso in due millilitri di mezzo di placcatura caldo all'interno di una piastra di Petri Grenier da 35 millilitri e posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per 18 ore. Il giorno successivo, controllare il chip tramite microscopia ottica per confermare che la maggior parte delle cellule si è attaccata. Rimuovere il mezzo dal piatto per rimuovere eventuali detriti e o cellule morte, e partendo dal centro e muovendosi verso i lati in modo drop-wise, aggiungere delicatamente PBS alle cellule.
Dopo il terzo lavaggio, sostituire il PBS con un mezzo di manutenzione di quattro millilitri e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare. Dopo 72 ore, sciacquare delicatamente la superficie del truciolo due volte con due millilitri di PBS per lavaggio caldo di Dulbecco come dimostrato e utilizzare le forcep per trasferire immediatamente il chip lavato in una nuova piastra sterile Grenier Petri da 35 millilitri. Aggiungere rapidamente 1,5 microlitri di vibrante diclo verde diluito 1000 piega in DPBS al chip.
Fissare una camera sopra il chip e posizionare il piatto sul portapiac piatti dello stadio di selezione cella. Inserire il cappuccio magnetico e individuare il mirino nella finestra della vista dal vivo. Concentrati sul mirino e, nella finestra di scansione e smistamento, seleziona la calibrazione per l'iniezione e la calibrazione automatizzate.
Sostituire il supernatante piatto con 1,5 millilitri di una tripla E uno-a-uno in soluzione DPBS per allentare le cellule dalla fibronectina e aprire la scheda di scansione. Per scansionare l'intero chip, concentrati sull'angolo in alto a sinistra del chip nel campo visivo e fai clic su ottieni la posizione corrente del microscopio. Quindi, concentrati sull'angolo in basso a destra del chip e fai clic su ottieni la posizione corrente del microscopio.
Nella finestra popup fare clic su Imposta piano più nitido e fare clic su vai in alto a destra e vai ai pulsanti d'angolo in basso a sinistra. Quindi, fare clic su Fine per iniziare la scansione. Al termine della scansione, aprire la scheda analisi e fare clic su Mostra mappa per selezionare le singole celle che superano i criteri di studio.
Centrare la microcapillaria di vetro al centro della vista dal vivo del microscopio e aprire la linguetta della pompa. Per creare un vuoto, ritrarre lo stantuffo da una siringa numero uno da 50 millilitri quattro millilitri e aprire la linguetta di ordinamento. Per consentire la raccolta di una singola cella, impostare la valvola due da aprire per 120 millisecondi e la valvola uno da aprire per 20 millisecondi dopo un time-lapse di 200 millisecondi.
Per consentire alla cella prelevata di essere consegnata correttamente al suo tubo PCR contenente tampone di lisi, impostare la valvola da aprire per 20 millisecondi e la valvola due da aprire per 10 millisecondi dopo un time-lapse di 10 millisecondi. Una volta regolate le impostazioni della valvola, fare clic su calcola il percorso. Il software computeri il percorso più veloce da cella a cella per il prelievo e l'iniezione delle celle selezionate in tutto il chip.
Quindi, focalizzare il microscopio su un motivo sulla superficie del truciolo. Utilizzare il joystick per spostare il microcapillare verso il basso con attenzione in modo che l'immagine più nitida della punta del microcapillare possa essere ottenuta senza toccare la superficie del chip e il set di clic. Si aprirà una nuova finestra che mostra la sezione trasversale microcapillare.
Per fare in modo che il software registri l'offset della punta del capillare nelle coordinate X, Y e Z, fare clic sul centro esatto del capillare. Quindi, fare clic su Avvia ordinamento per avviare l'ordinamento. In questa analisi rappresentativa del cDNA pre-amplificato da una singola cella prelevata, è stata osservata una banda chiara nel gel come la trama densitometrica corrispondente al picco a 1.852 coppie di basi nell'elettroferogramma.
La dimensione media dei frammenti era di 1.588 coppie di basi con un piccolo numero di frammenti che erano più corti di 300 coppie di basi, indicando la generazione di una buona libreria cDNA. La colorazione e l'analisi immunofluorescenti possono anche essere eseguite per valutare la struttura del sarcomero all'interno dei cardiomiociti modellati. Questa piattaforma apre la strada allo studio ad alta produttività e allo screening farmacologico di diversi tipi di insufficienza cardiaca.
