Questo lavoro è stato sostenuto dal Piano di sviluppo scientifico e tecnologico del 2020 nella città di Jinan (numero di sovvenzione 202019059), dal progetto di scienza e tecnologia della medicina tradizionale cinese della provincia di Shandong (numero di sovvenzione 2021Q080) e dal progetto di ereditarietà della Scuola di medicina tradizionale cinese Qilu (numero di sovvenzione [2022]93).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (Numero: AWE-2022-023).
1. Animali da esperimento
<ol><li>Venti ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) (7 settimane di età, 250-280 g) sono stati alloggiati in condizioni standard (temperatura ambiente [RT] 20-24 °C, umidità 40%-60% e un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore).</li>
</ol>2. Metodo di raggruppamento
<ol><li>Raggruppare i ratti SD in gruppo di controllo (C), gruppo di controllo modello FS (M), gruppo di trattamento Tuina modello FS (MT) e gruppo di trattamento orale modello FS (MO), ciascuno composto da 5 ratti. Tenere 5 ratti per gabbia (stesso gruppo).</li>
	<li>Dopo 7 giorni di acclimatazione, immobilizzare una spalla dei ratti nei gruppi M, MT e MO utilizzando l'immobilizzazione con gesso per 3 settimane per imitare la FS come descritto nella sezione successiva.</li>
	<li>Somministrare la terapia con Tuina ai ratti del gruppo MT per 2 settimane, come descritto nel paragrafo 4 (Figura 1).</li>
	<li>Calcolare il dosaggio richiesto di desametasone per ogni chilogrammo di ratti (0,0675 mg/die) in base al dosaggio per adulti (0,75 mg/die) e al rapporto tra la superficie del ratto e quella del corpo umano (0,018).</li>
	<li>Somministrare giornalmente una soluzione intragastrica di desametasone ai ratti del gruppo MO alla dose di 0,067 mg/kg/die alle 7:00 AM per 2 settimane. NOTA: Utilizzare questo metodo di raggruppamento per confermare l'effetto del protocollo Tuina in questo studio. Eseguire il metodo di raggruppamento in base a scopi sperimentali in diversi studi.</li>
</ol>3. Sviluppo del modello FS
<ol><li>Anestetizzare i ratti con tribromoetanolo (250 mg/kg, mediante iniezione intraperitoneale)11. NOTA: In conformità con i requisiti del comitato etico dell'istituto, è stata conservata una soluzione madre composta da tribomoetanolo (10 g) e alcol terz-amilico (10 ml) a 4 °C.  Prima dell'uso, è stato diluito al 2% con acqua distillata.</li>
	<li>Applicare bende imbevute di gesso sulla spalla destra e sul torace dei ratti, mantenendo l'arto anteriore destro a 90° di rotazione interna dell'articolazione della spalla per 3 settimane (Figura 2)12. NOTA: Monitorare i ratti per assicurarsi che possano svolgere normali attività fisiologiche come camminare, mangiare e bere. Rifissare la benda di gesso se i ratti non sono in grado di svolgere le normali attività fisiologiche.</li>
	<li>Confermare il successo dell'affermazione del modello FS osservando lo sviluppo di sintomi come rigidità nell'articolazione della spalla destra, contrazione dell'arto superiore destro, atrofia muscolare e zoppia nei ratti13.</li>
</ol>4. Metodo Tuina
NOTA: Durante tutta la procedura, lo sperimentatore deve indossare dispositivi di protezione individuale. Tutte le manipolazioni devono essere eseguite da un solo medico professionista (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
<ol><li>Allenati con il sistema di determinazione dei parametri della tecnica di massaggio intelligente, che include un meccanorecettore e un computer (Figura 3A).<ol><li>Eseguire manipolazioni sui parametri meccanorecettori e forza in tre direzioni visualizzate tramite software (Figura 3B).</li>
		<li>Utilizzare il dito del pollice per eseguire il metodo di impastamento rotatorio con un movimento rotatorio con una forza di 0,5 kg e una frequenza di 100-120 volte/min (Figura 3C).</li>
		<li>Utilizzare la punta del pollice per eseguire il metodo di pressatura a punta con una forza di 0,5 kg (Figura 3D).</li>
		<li>Eseguire Tuina sui ratti mantenendo il display meccanico menzionato nei passaggi 4.1.2 e 4.1.3 per 1 minuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Tenere il ratto finché non si calma (~2 min). Quindi, eseguire la manipolazione. Posizionare il ratto in posizione sdraiata laterale, ma la posizione può cambiare in base ai diversi metodi di manipolazione.</li>
	<li>Usa l'indice e il medio destro per bloccare l'arto anteriore destro del ratto e fletterlo ed estenderlo più volte per determinare le posizioni dell'articolazione della spalla, dell'articolazione del gomito e dell'omero del ratto.</li>
	<li>Impastare la spalla destra, l'arto anteriore e la schiena del ratto ruotando in senso orario con la polpa del pollice a una forza di 0,5 kg e una frequenza di 100-120 volte/min per 3 minuti (Figura 4A-C).<ol><li>Manipolare i muscoli degli arti anteriori in posizione sdraiata laterale.</li>
		<li>Manipola i muscoli della spalla e della schiena in posizione prona.</li>
	</ol></li>
	<li>Premere verticalmente i punti di agopuntura LI15 (Jianyu), SI11 (Tianzong), HT01 (Jiquan) e LI11 (Quchi) verticalmente con la punta del pollice 30 volte per agopunto con una forza di 0,5 kg (Figura 4D-G).<ol><li>Utilizzare l'atlante dei punti di agopuntura dei ratti per definire la posizione di ciascun agopunto (Figura 5)14,15.</li>
		<li>Premere LI15, situato nella depressione antero-inferiore all'estremità acromiale, in posizione prona.</li>
		<li>Premere SI11, situato nella depressione della fossa infraspinata nel punto medio della colonna scapolare, in posizione prona.</li>
		<li>Premere HT01, situato al centro dell'ascella, in posizione supina.</li>
		<li>Premere LI11 situato nella depressione mediale all'estensore radiale del carpo all'estremità laterale della piega cubitale in posizione sdraiata laterale.</li>
	</ol></li>
	<li>Tenere l'articolazione della spalla con il pollice sinistro e il medio e allungare l'arto anteriore nelle posizioni di adduzione, abduzione, estensione anteriore ed estensione posteriore per 10 secondi (Figura 4H-K). NOTA: Questo metodo di allungamento deve essere eseguito senza resistenza nei ratti.</li>
	<li>Mettere in pausa la procedura Tuina se il ratto si agita. Accarezza il ratto per 10 secondi per calmarlo, quindi procedi con la prova.</li>
	<li>Eseguire la procedura ogni giorno per 2 settimane.</li>
</ol>5. Misurazione del ROM gleno-omerale
NOTA: È importante completare il processo di misurazione il più rapidamente possibile per prevenire la degenerazione del tessuto della capsula articolare.
<ol><li>Rimuovere la scapola e i due terzi prossimali dell'omero in blocco dopo aver sacrificato il ratto con un dosaggio eccessivo di tribromoetanolo (3 volte la dose iniziale, mediante iniezione intraperitoneale), esponendo il bordo inferiore della scapola.</li>
	<li>Inserire un ago per iniezione (1,2 cm x 0,45 mm) lungo l'asta omerale nella testa omerale.</li>
	<li>Inserire due aghi per iniezione verticalmente negli angoli superiore e inferiore della scapola su schiuma di plastica avvolta con un foglio chirurgico sterile.</li>
	<li>Collegare un filo sottile all'ago per iniezione sull'asta omerale e tirarlo all'altra estremità con una forza di 5 g per renderlo parallelo all'asta omerale. Misurare l'angolo tra il bordo inferiore della scapola e l'asta omerale (Figura 6). NOTA: Per garantire risultati affidabili, chiedere a uno sperimentatore separato di eseguire le misurazioni.</li>
	<li>Riportare i dati come media ±deviazione standard (SD) utilizzando un'applicazione software di analisi statistica. NOTA: in questo caso è stato utilizzato il software SPSS (SPSS, versione 25.0).</li>
	<li>Analizza le differenze tra i gruppi utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA).</li>
	<li>Ottenere la grafica a barre utilizzando il software appropriato. NOTA: In questo caso è stato utilizzato GraphPad Prism 8.</li>
	<li>Valutare la patologia della capsula utilizzando la colorazione H&E e Masson dopo la misurazione.</li>
</ol>6. Preparazione della sezione
<ol><li>Dopo aver valutato il ROM gleno-omerale, fissare i campioni interi in PFA al 4% per 3 giorni, seguiti da decalcificazione in soluzione di EDTA (pH 7,2) per altri 2 mesi.</li>
	<li>Dopo la disidratazione, suddividere i blocchi di tessuto incorporati contenenti i campioni in fette da 5 μm16.</li>
	<li>Asciugare la fetta a 65 °C per 60 min.</li>
	<li>Decerare la fetta.</li>
	<li>Immergere la fetta in xilene I, xilene II e xilene III per 7 minuti, seguita da una serie di etanolo discendente (etanolo anidro, 5 min; etanolo al 95%, 2 min; etanolo all'80%, 2 min, ed etanolo al 70%, 2 min) e infine in acqua ultrapura per 2 min.</li>
</ol>7. Colorazione H&E
<ol><li>Colorare le sezioni con ematossilina per 5 minuti, risciacquare con etanolo acido cloridrico all'1% per 3 secondi e lavare con acqua corrente per 5 minuti.</li>
	<li>Colorare la ciocca con eosina per 3 minuti e lavare con acqua di rubinetto.</li>
	<li>Immergere la sezione in una serie di etanolo (95% etanolo I, 3 s; 95% etanolo II, 3 s; etanolo anidro I, 3 s, ed etanolo anidro II, 1 min) e poi immergere in una serie di xilene (xilene I, 1 min; xilene II, 1 min).</li>
	<li>Applicare una goccia di sigillante neutro su ciascun campione. Sigillare ogni campione con un vetro di copertura.</li>
	<li>Raccogliere le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita (barra della scala = 100 μm).</li>
</ol>8. Colorazione di Masson
<ol><li>Usando una penna immunoistochimica, disegna un cerchio attorno alle sezioni e poi incuba le sezioni nella soluzione di Bouin per 2 ore a 37 °C fino a mordente. Successivamente, lavare le sezioni con acqua fino a quando il colore giallo non scompare.</li>
	<li>Trattare i campioni con colorante blu lapislazzuli per 3 minuti e poi lavarli con acqua distillata.</li>
	<li>Dopo aver colorato le sezioni con ematossilina (Mayer) per 2 minuti, trattare le sezioni per 3 secondi nella soluzione acida di differenziazione dell'etanolo. Quindi, lavare le sezioni in acqua corrente per 10 min.</li>
	<li>Colorare le sezioni con una soluzione di colorante ponceau magenta per 10 minuti e successivamente lavarle con acqua.</li>
	<li>Immergere le sezioni nella soluzione di acido fosfomolibdico per 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione colorante blu all'anilina alle sezioni per 5 minuti, quindi lavarle con una soluzione di lavoro acida debole per 2 minuti.</li>
	<li>Disidratare e rendere trasparenti le sezioni come descritto al punto 7.3.</li>
	<li>Metti una goccia di sigillante neutro su ogni sezione e coprila con un vetro di copertura. Lasciare asciugare le sezioni in una cappa aspirante.</li>
	<li>Raccogliere le immagini come descritto al punto 7.5.</li>
</ol>

Terapia Tuina per spalle congelate in un modello di ratto

<ol>
	<li>Li, W., LU, N. Z., Xu, H. L., Wang, H. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+control+study+of+risk+factors+for+frozen+shoulder+in+China.">Case control study of risk factors for frozen shoulder in China.</a> International Journal of Rheumatic Diseases. 18 (5), 508-513 (2015).</li><li>Degreef, I., Steeno, P., De Smet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clinical+manifestations+and+risk+factors+in+women+with+Dupuytren's+disease.">A survey of clinical manifestations and risk factors in women with Dupuytren's disease.</a> Acta Orthopaedica Belgica. 74 (4), 456-460 (2008).</li><li>Tighe, C. B., Oakley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+a+diabetic+condition+and+adhesive+capsulitis+of+the+shoulder.">The prevalence of a diabetic condition and adhesive capsulitis of the shoulder.</a> Southern Medical Journal. 101 (6), 591-595 (2008).</li><li>Cho, C. H., Bae, K. C., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+strategy+for+frozen+shoulder.">Treatment strategy for frozen shoulder.</a> Clinics in Orthopedic Surgery. 11 (3), 249-257 (2019).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+massage+and+acupuncture+on+the+range+of+motion+and+daily+living+ability+of+patients+with+frozen+shoulder+complicated+with+cervical+spondylosis.">Effects of massage and acupuncture on the range of motion and daily living ability of patients with frozen shoulder complicated with cervical spondylosis.</a> American Journal of Translational Research. 13 (4), 2804-2812 (2021).</li><li>Ai, J., Dong, Y. K., Tian, Q. D., Wang, C. L., Fang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuina+for+periarthritis+of+shoulder:+A+systematic+review+protocol.">Tuina for periarthritis of shoulder: A systematic review protocol.</a> Medicine. 99 (11), e19332 (2020).</li><li>Norlin, R., Hoe-Hansen, C., Oquist, G., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shoulder+region+of+the+rat:+anatomy+and+fiber+composition+of+some+suprascapular+nerve+branches.">Shoulder region of the rat: anatomy and fiber composition of some suprascapular nerve branches.</a> The Anatomical Record. 239 (3), 332-342 (1994).</li><li>Okajima, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+model+of+adhesive+capsulitis+of+the+shoulder.">Rat model of adhesive capsulitis of the shoulder.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), 58335 (2018).</li><li>Zhao, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrandrine+inhibits+the+occurrence+and+development+of+frozen+shoulder+by+inhibiting+inflammation,+angiogenesis,+and+fibrosis.">Tetrandrine inhibits the occurrence and development of frozen shoulder by inhibiting inflammation, angiogenesis, and fibrosis.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 140, 111700 (2021).</li><li>nar, B. M., Battal, V. E., Bal, N., G&#252;ler, &. #. 2. 2. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Beyaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+efficacy+of+oral+versus+intra-articular+corticosteroid+application+in+the+treatment+of+frozen+shoulder:+An+experimental+study+in+rats.">Comparison of efficacy of oral versus intra-articular corticosteroid application in the treatment of frozen shoulder: An experimental study in rats.</a> Acta Orthopaedica et Traumatologica Turcica. 56 (1), 64-70 (2022).</li><li>Dias, Q. M., Rossaneis, A. C., Fais, R. S., Prado, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+experimental+model+for+peripheral+neuropathy+in+rats.">An improved experimental model for peripheral neuropathy in rats.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 46 (3), 253-256 (2013).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+frozen+shoulder+model+using+immobilization+in+rats.">Characterization of a frozen shoulder model using immobilization in rats.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 160 (2016).</li><li>Feusi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+as+a+potential+prophylactic+measure+against+frozen+shoulder+in+an+in+vivo+shoulder+contracture+model.">Platelet-rich plasma as a potential prophylactic measure against frozen shoulder in an in vivo shoulder contracture model.</a> Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 142 (3), 363-372 (2022).</li><li>Yin, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proposed+transpositional+acupoint+system+in+a+mouse+and+rat+model.">A proposed transpositional acupoint system in a mouse and rat model.</a> Research in Veterinary Science. 84 (2), 159-165 (2008).</li><li>Guo, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+regulatory+mechanism+of+electroacupuncture+based+on+thyroid+pathway+for+mammary+gland+hyperplasia+rats.">Study on the regulatory mechanism of electroacupuncture based on thyroid pathway for mammary gland hyperplasia rats.</a> Zhongguo Zhen Jiu. 38 (8), 857-863 (2018).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Taguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+frozen+shoulder+demonstrating+the+effect+of+transcatheter+arterial+embolization+on+angiography,+histopathology,+and+physical+activity.">A rat model of frozen shoulder demonstrating the effect of transcatheter arterial embolization on angiography, histopathology, and physical activity.</a> Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 32 (3), 376-383 (2021).</li><li>Oki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+a+novel+shoulder+contracture+mouse+model.">Generation and characterization of a novel shoulder contracture mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1732-1738 (2015).</li><li>Kubo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+examination+of+the+shoulder+capsule+shows+new+layer+of+elastic+fibres+between+synovial+and+fibrous+membrane.">Histologic examination of the shoulder capsule shows new layer of elastic fibres between synovial and fibrous membrane.</a> Journal of Orthopaedics. 22, 251-255 (2020).</li><li>Cho, C. H., Lho, Y. M., Hwang, I., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metalloproteinases+2+and+9+in+the+development+of+frozen+shoulder:+human+data+and+experimental+analysis+in+a+rat+contracture+model.">Role of matrix metalloproteinases 2 and 9 in the development of frozen shoulder: human data and experimental analysis in a rat contracture model.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 28 (7), 1265-1272 (2019).</li><li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+Tuina+and+intermediate+frequency+electrotherapy+for+frozen+shoulder:+MRI-based+observation+evidence.">Efficacy and safety of Tuina and intermediate frequency electrotherapy for frozen shoulder: MRI-based observation evidence.</a> American Journal of Translation Research. 15 (3), 1766-1778 (2023).</li><li>Ben-Arie, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effectiveness+of+acupuncture+in+the+treatment+of+frozen+shoulder:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">The effectiveness of acupuncture in the treatment of frozen shoulder: A systematic review and meta-analysis.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2020, 9790470 (2020).</li><li>Zou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+electroacupuncture+at+hegu,+shousanli,+and+quchi+based+on+the+theory+&amp;#34;Treating+flaccid+paralysis+by+Yangming+alone&amp;#34;+on+stroke+patients'+EEG:+A+pilot+study.">The impact of electroacupuncture at hegu, shousanli, and quchi based on the theory &amp;#34;Treating flaccid paralysis by Yangming alone&amp;#34; on stroke patients' EEG: A pilot study.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2020, 8839491 (2020).</li><li>Lv, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RNA-Seq+to+explore+the+repair+mechanism+of+the+three+methods+and+three-acupoint+technique+on+DRGs+in+sciatic+nerve+injured+rats.">Using RNA-Seq to explore the repair mechanism of the three methods and three-acupoint technique on DRGs in sciatic nerve injured rats.</a> Pain research &amp; Management. 2020, 7531409 (2020).</li><li>Niu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+tuina+improves+cognitive+impairment+in+cerebral+palsy+rats+through+inhibiting+pyroptosis+induced+by+NLRP3+and+Caspase-1.">Spinal tuina improves cognitive impairment in cerebral palsy rats through inhibiting pyroptosis induced by NLRP3 and Caspase-1.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 1028909 (2021).</li><li>Na, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+electroacupuncture+and+massage+therapy+alleviates+myofibroblast+transdifferentiation+and+extracellular+matrix+production+in+blunt+trauma-induced+skeletal+muscle+fibrosis.">The combination of electroacupuncture and massage therapy alleviates myofibroblast transdifferentiation and extracellular matrix production in blunt trauma-induced skeletal muscle fibrosis.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2021, 5543468 (2021).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il primo passo critico è la selezione del modello. A causa della difficoltà nell'implementazione del modello FS primario, l'immobilizzazione del gesso e la fissazione interna chirurgica sono spesso utilizzate per stabilire modelli di ratto FS 9,12. La restrizione più grave della mobilità della spalla e la fibrosi della capsula sono state osservate nel modello FS stabilito mediante immobilizzazione ingessata per 3 settimane12,20. In questo studio, le percentuali di successo del modello FS sono state eccellenti, con un successo del 100%.
Il secondo passaggio critico sono le manipolazioni utilizzate in questo protocollo. In questo studio sono state utilizzate tre manipolazioni (impastamento, pressatura e allungamento). La manipolazione dell'impastamento dei tessuti molli è stata applicata alla spalla, alla scapola e alla parte superiore del braccio per rilassare i muscoli. La manipolazione della pressione è stata eseguita applicando pressione ai punti di agopuntura come LI15, SI11, HT01 e LI11, che sono più comunemente usati nella pratica clinica per FS 5,21. LI15, SI11 e HT01 si trovano in posizioni intorno alla capsula della spalla e possono essere efficaci nel migliorare la ROM e la funzione della spalla22. LI11 è spesso usato per la compromissione motoria degli arti superiori e si trova nello stesso meridiano di LI15. Questo metodo di corrispondenza dei punti di agopuntura aiuta a migliorare l'efficacia di LI1523. Dopo il completo rilassamento, sono state utilizzate tecniche di stretching per ripristinare le attività funzionali.
Il possibile problema di questo protocollo è che i ratti mostrano un'intensa resistenza durante il Tuina, che può essere causata dalla paura piuttosto che dal superamento della tolleranza dei ratti. A questo punto, le manipolazioni dovrebbero essere interrotte fino a quando i ratti non si calmano (accarezzare per 10 s calma i ratti). Inoltre, l'entità dello stretching deve essere regolata in base ai sintomi dei ratti. Inizialmente, la limitazione dell'articolazione della spalla era ovvia e l'ampiezza di allungamento era piccola. Insieme all'intervento, la funzione dell'articolazione della spalla dei ratti si è gradualmente ripresa e l'ampiezza dell'allungamento è progressivamente aumentata. Lo standard è che i ratti possono accettare il metodo di allungamento senza resistenza. Infine, i ratti hanno un certo grado di aggressività e Tuina richiede un contatto prolungato con i ratti, quindi è importante indossare dispositivi di protezione individuale.
Il controllo quantitativo della manipolazione è il più difficile negli esperimenti Tuina. Mentre un simulatore di manipolazione del massaggio può essere utilizzato per controllare la forza e la frequenza di una singola manipolazione, questo metodo è limitato quando sono coinvolte più manipolazioni e siti di trattamento24,25. Nella pratica clinica, Tuina viene in genere eseguito direttamente dai medici e in questo studio è stato difficile intervenire con apparecchiature mediche. Per controllare la stimolazione, il sistema intelligente di determinazione dei parametri della tecnica di massaggio può essere utilizzato per standardizzare l'allenamento di Tuina. Dopo l'addestramento, l'investigatore può applicare la stessa forza a ciascun ratto in una certa misura. Il principale limite di questo protocollo è che le manipolazioni non possono essere completamente controllate.
La terapia TCM Tuina ha una ricca storia di utilizzo in tutta la Cina, con vari medici negli ospedali che utilizzano diverse combinazioni di manipolazione e sito di trattamento. Pertanto, è importante stabilire protocolli replicabili ed efficaci sia per gli esperimenti sugli animali che per gli studi clinici. In questo studio, le manipolazioni e i punti di agopuntura utilizzati si basavano su uno studio precedente del nostro team, combinando la nostra esperienza clinica con le caratteristiche del modello animale FS21. Questo studio ha dimostrato l'efficacia del protocollo Tuina sviluppato nel migliorare la funzione dell'articolazione della spalla e nel ridurre la fibrosi della capsula nei ratti FS. Questi risultati forniscono una base per ulteriori indagini sui meccanismi alla base del trattamento con Tuina. Inoltre, il protocollo può essere utile per i ricercatori interessati ad esplorare l'efficacia di trattamenti medici alternativi per la FS.
Uno studio precedente ha scoperto che il meccanismo dell'intervento di Tuina sulla fibrosi può essere correlato alla sottoregolazione di TGF-β e CTGF mentre regola l'equilibrio di MMP-1/TIMP-1, alleviando così la produzione di matrice extracellulare (ECM)26. L'effetto di Tuina sulla fibrosi della capsula della spalla può essere ottenuto attraverso la regolazione di vari meccanismi. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi coinvolti in questo miglioramento.

La spalla congelata (FS), nota anche come capsulite adesiva della spalla, è una malattia autolimitante caratterizzata da dolore alla spalla e deficit di mobilità. Colpisce tipicamente le persone di età compresa tra i 30 e i 70 anni, con un'età media di 50 anni, e ha una prevalenza di circa il 5% nella popolazione cinese1. Le femmine hanno un'incidenza 1,6 volte maggiore di FS rispetto ai maschi2. La prevalenza di FS è maggiore nelle persone con diabete, disturbi del metabolismo del glucosio e dei lipidi o altre malattie correlate, compresa tra il 10% e il 36%2,3. Gli attuali trattamenti clinici per la FS includono fisioterapia, farmaci steroidei e trattamenti chirurgici4.
Tuina, una terapia di medicina tradizionale cinese (MTC), ha dimostrato di alleviare efficacemente il dolore alla spalla nei pazienti con FS, migliorando la loro qualità di vita 5,6. Tuttavia, i meccanismi alla base di questo trattamento non sono ben compresi. Pertanto, l'utilizzo di modelli animali per studiare gli effetti e i meccanismi del Tuina nel trattamento della FS è fondamentale.
L'articolazione della spalla del ratto ha una struttura complessa simile a quella della spalla umana ed è spesso utilizzata negli studi meccanicistici di FS7. Il modello di ratto FS è caratterizzato da un declino del ROM gleno-omerale e della fibrosi capsulare8. Inoltre, questo modello consente l'osservazione della capsula della spalla e consente la ricerca patologica durante la riparazione della lesione9. Inoltre, i corticosteroidi orali sono spesso utilizzati come gruppo di controllo nella ricerca sul trattamento della FS10. Questo studio mira a sviluppare un protocollo Tuina per il modello di ratto FS e dimostra la fattibilità di condurre esperimenti sugli animali nella ricerca Tuina confrontando l'efficacia della terapia Tuina e del desametasone orale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Changzhou Paisijie Medical Equipment Co., Ltd</td>
			<td>BM450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>E1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin eosin (HE) staining kit</td>
			<td>Sparkjade</td>
			<td>EE0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelligent-massage technique parameter determination system</td>
			<td>Shanghai Dukang Intrument Equipment Co. Ltd</td>
			<td>ZTC-<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65440/65440eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>531CM-Y43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			Modified Masson Trichrome Staining Solution</td>
			<td>Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td>
			<td>R20381-8</td>
			<td>Bouin 50 mL; 
			lapis lazuli blue dye 50 mL; 
			Hematoxylin (Mayer) 50 mL; 
			acidic ethanol differentiation solution 50 mL; 
			ponceau magenta dye solution 50 mL; 
			phosphomolybdic acid solution 50 mL; 
			aniline blue staining solution 50 mL; 
			&#160;weak acid 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>T903147-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tuina in a frozen shoulder rat model: an efficient and reproducible protocol

La spalla congelata (FS) è una condizione comune per la quale non è stata definita una terapia ottimale. La terapia Tuina, una tecnica di medicina tradizionale cinese (MTC) utilizzata per trattare i pazienti affetti da FS negli ospedali cinesi, ha dimostrato ottimi risultati, ma i suoi meccanismi non sono del tutto compresi. Sulla base di uno studio precedente, questo lavoro mirava a sviluppare un protocollo Tuina per un modello di ratto FS. Sono stati divisi in modo casuale 20 ratti SD in gruppi di controllo (C; n = 5), modello FS (M; n = 5), trattamento Tuina modello FS (MT; n = 5) e trattamento orale modello FS (MO; n = 5). Questo studio ha utilizzato il metodo di immobilizzazione del gesso per stabilire il modello di ratto FS. È stato valutato l'effetto di Tuina e desametasone orale sul range di movimento gleno-omerale (ROM) e sono stati valutati i risultati istologici. Il nostro studio ha dimostrato che Tuina e desametasone orale sono stati in grado di migliorare il ROM attivo della spalla e preservare la struttura della capsula, con la terapia Tuina che si è dimostrata più efficace del desametasone orale. In conclusione, il protocollo Tuina stabilito in questo studio è stato altamente efficace per FS.

Frozen shoulder (FS), also known as adhesive capsulitis of the shoulder, is a self-limiting disease characterized by shoulder pain and mobility deficits. It typically affects people between the ages of 30 and 70 years old, with a mean age of 50 years, and has a prevalence of around 5% in the Chinese population1. Females are reported to have a 1.6 times higher incidence of FS compared to males2. The prevalence of FS is higher in people with diabetes, glucose and lipid metabolism disorders or other related diseases, ranging between 10% and 36%2,3. Current clinical treatments for FS include physiotherapy, steroid medications, and surgical treatments4.
Tuina, a traditional Chinese medicine (TCM) therapy, has been shown to effectively relieve shoulder pain in FS patients, improving their quality of life5,6. However, the underlying mechanisms of this treatment are not well understood. Thus, using animal models to study the effects and mechanisms of Tuina in treating FS is crucial.
The rat shoulder joint has a complex structure similar to that of the human shoulder and is often used in mechanistic studies of FS7. The FS rat model is characterized by a decline in glenohumeral ROM and capsule fibrosis8. Furthermore, this model allows for the observation of the shoulder capsule and enables pathological research while repairing the injury9. Moreover, oral corticosteroids are often used as the control group in FS treatment research10. This study aims to develop a Tuina protocol for the FS rat model and demonstrates the feasibility of conducting animal experiments in Tuina research by comparing the efficacy of Tuina therapy and oral dexamethasone.

Autore in primo piano: Indagine sull'efficacia della terapia Tuina per la spalla congelata 

Tuina in un modello di ratto spalla congelato: un protocollo efficiente e riproducibile

Our study aims to understand the mechanisms and the clinical effectiveness of Tuina therapy. Based on previous research, we are developing a Tuina protocols specifically for the frozen shoulder rat model. This study demonstrated the effectiveness of the developed Tuina protocol in improving shoulder joint function and reducing capsule fibrosis in affected rats.Tuina may regulate various mechanism to achieve an effect on the fibrosis of the shoulder capsule. The findings of this study lay the groundwork for further research into the mechanisms involved in Tuina treatment. In the future, we will continue using this protocol to treat frozen shoulders in rats and employ proteomics technique to investigate mechanisms related to capsule fibrosis treatment in these rats.

L'attività fisica dei ratti è stata osservata per valutare il successo o il fallimento del modello FS. Uno studio precedente ha dimostrato che l'immobilizzazione ingessata riduceva significativamente la distanza percorsa e la velocità di deambulazione rispetto ai ratti normali17. Un'altra ricerca ha suggerito che la FS non ha influenzato la distanza percorsa e la zoppia era il sintomo di presentazione più comune13. Questo studio ha mostrato rigidità nell'articolazione della spalla destra, contrazione dell'arto superiore destro, atrofia muscolare e zoppia nei ratti dopo la modellazione. Queste lesioni nei gruppi MT e MO sono state risolte completamente entro 2 settimane di intervento. Ma non c'è stato alcun cambiamento significativo nel gruppo M.
Il criterio principale per valutare l'efficacia di Tuina nella FS è la misurazione del ROM18 gleno-omerale. Abbiamo osservato che i valori medi del ROM gleno-omerale erano 149,3° ± 5,9° nel gruppo C, 111,1° ± 3,9° nel gruppo M, 128,5° ± 2,8° nel gruppo MT e 119,56° ± 2,9° nel gruppo MO. Come illustrato nella Figura 7, il ROM gleno-omerale dei ratti del gruppo M era significativamente inferiore a quello del gruppo C (P < 0,0001). Inoltre, il ROM nel gruppo MT e nel gruppo MO era significativamente superiore a quello del gruppo M (P < 0,05, P < 0,0001). Tuttavia, il ROM nel gruppo MO era significativamente inferiore a quello nel gruppo MT (P < 0,0001). Questa scoperta suggerisce che Tuina può migliorare significativamente la funzione dell'articolazione della spalla nei ratti FS.
Inoltre, la colorazione H&E e la colorazione Masson possono dimostrare ulteriormente gli effetti di Tuina nel preservare la struttura e ridurre la fibrosi nella capsula. Per facilitare l'osservazione, la capsula dell'articolazione gleno-omerale è stata utilizzata per i risultati istologici. La capsula dell'articolazione della spalla comprende strati sinoviali e fibrosi19. La colorazione H&E ha rivelato la proliferazione dei sinoviociti, l'appiattimento delle pieghe sinoviali, la stasi eritrocitaria e la proliferazione vascolare nel gruppo M, che sono caratteristiche tipiche della FS (Figura 8A, B). Queste caratteristiche sono diminuite in una certa misura dopo la terapia con Tuina e desametasone orale (Figura 8C,D). Rispetto al gruppo MT, il gruppo MO ha anche mostrato molte cellule sinoviali. La colorazione di Masson ha mostrato la disposizione dei fasci di fibre in ciascun gruppo (frecce gialle). La capsula è costituita da una rete sciolta di fibre reticolari con fasci di fibre disposte in direzione ordinata (Figura 8E). Nel gruppo M, i fasci di fibre erano disposti in modo disordinato, indicando la fibrosi della capsula (Figura 8F). Le capsule di ratti nel gruppo MT hanno mostrato che i fasci di fibre sono ordinatamente e chiaramente stratificati, ma rimangono leggermente disordinati nel gruppo MO (Figura 8G,H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig01.jpg"> Figura 1: Protocollo per la definizione del modello FS e dell'intervento Tuina. I ratti sono stati sottoposti ad alimentazione adattiva per 7 giorni, il modello FS per 21 giorni e la terapia Tuina è stata eseguita quotidianamente per 14 giorni. Il giorno 36, tutti i ratti sono stati sacrificati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig02.jpg"> Figura 2: Immobilizzazione del gesso per stabilire un modello di ratto di FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig03.jpg"> Figura 3: Controllo quantitativo della manipolazione . (A) Sistema intelligente di determinazione dei parametri della tecnica di massaggio. (B) Tre forze possono essere misurate come forza parallela lungo la direzione X, forza longitudinale lungo la direzione Y e forza verticale lungo la direzione Z. (C) Forza del metodo di impastamento rotativo. La curva rossa rappresenta la forza verticale stabilizzata (0,5 kg). La curva arancione rappresenta la forza parallela regolare. La curva bianca rappresenta la forza longitudinale regolare. (D) La forza del metodo di pressatura a punti. La curva rossa rappresenta la forza verticale (0,5 kg). Le curve arancioni e bianche rappresentano forze non parallele e longitudinali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig04.jpg"> Figura 4: Manipolazione utilizzata nella terapia Tuina. (A-C) Impastare i muscoli delle spalle destre, degli arti anteriori e della schiena. (D-G) Premere il punto LI15, SI11, HT01 e LI11. (H-K) Allungare l'arto anteriore nelle posizioni di adduzione, abduzione, estensione anteriore ed estensione posteriore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig05.jpg"> Figura 5: Posizioni anatomiche di LI15, SI11, HT01 e LI11 nei ratti. ● Superficie laterale, ○ Superficie mediale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig06.jpg"> Figura 6: Misurazione del ROM gleno-omerale. Un filo sottile viene attaccato a un ago per iniezione inserito nell'asta omerale e tirato all'altra estremità con una forza di 5 g per renderlo parallelo all'asta omerale. L'angolo tra il bordo inferiore della scapola e l'asta omerale è misurato come ROM gleno-omerale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig07.jpg"> Figura 7: ROM gleno-omerale in tre gruppi di ratti. I valori sono mezzi ± S.D., n = 5. Le differenze significative sono indicate dall'ANOVA unidirezionale (a P < 0,001 e bP < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65440/65440fig08.jpg"> Figura 8: Reperti istologici della capsula di spalla. (A,E) Il gruppo di controllo contiene una struttura normale della capsula (colorazione H&E e Masson). (B,F) Il gruppo di modelli FS illustra i cambiamenti nella struttura della capsula come segue: pieghe sinoviali appiattite, fibrosi della capsula e fasci di fibre disturbate (colorazione H&E e Masson). (C,G). Il modello FS combinato con il gruppo Tuina illustra che la struttura della capsula è vicina alla normalità e la fibrosi non è evidente (colorazione H&E e Masson). (D,H) Il modello FS combinato con desametasone orale mostra che la struttura della capsula è vicina alla normalità e la fibrosi è evidente (colorazione H&E e Masson). Barra della scala = 100 μm. HH: testa dell'omero; freccia nera: pieghe sinoviali; freccia rossa: stasi eritrocitaria e proliferazione vascolare; Freccia gialla: fasci di fibre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65440/65440fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effectiveness of Tuina Therapy for Frozen Shoulder at JoVE.com

Questo studio sviluppa un protocollo Tuina efficiente e riproducibile per il trattamento della spalla congelata stabilito in un modello di ratto. Questo approccio aiuterà a studiare il metodo di trattamento della terapia Tuina per le spalle congelate.

Frozen shoulder (FS) is a common condition with no defined optimal therapy. Tuina therapy, a traditional Chinese medicine (TCM) technique used to treat FS ...

Il nostro studio mira a comprendere i meccanismi e l'efficacia clinica della terapia Tuina. Sulla base di ricerche precedenti, stiamo sviluppando un protocollo Tuina specifico per il modello di ratto spalla congelato. Questo studio ha dimostrato l'efficacia del protocollo Tuina sviluppato nel migliorare la funzione dell'articolazione della spalla e ridurre la fibrosi capsulare nei ratti affetti.Tuina può regolare vari meccanismi per ottenere un effetto sulla fibrosi della capsula della spalla. I risultati di questo studio gettano le basi per ulteriori ricerche sui meccanismi coinvolti nel trattamento Tuina. In futuro, continueremo a utilizzare questo protocollo per trattare le spalle congelate nei ratti e impiegheremo la tecnica proteomica per studiare i meccanismi correlati al trattamento della fibrosi capsula in questi ratti.

tuina-frozen-shoulder-rat-model-an-efficient-reproducible

Research

JoVE Journal

Medicine

Tuina in a Frozen Shoulder Rat Model: An Efficient and Reproducible Protocol

1.3K Views.  Shandong University of Traditional Chinese Medicine. Il nostro studio mira a comprendere i meccanismi e l'efficacia clinica della terapia Tuina. Sulla base di ricerche precedenti, stiamo sviluppando un protocollo Tuina specifico per il modello di ratto spalla congelato. Questo studio ha dimostrato l'efficacia del protocollo Tuina sviluppato nel migliorare la funzione dell'articolazione della spalla e ridurre la fibrosi capsulare nei ratti affetti.Tuina può regolare vari meccanismi per ottenere un effetto sulla fibrosi della capsula dell...