Gli autori ringraziano diversi utenti di Twitter che hanno sollevato domande sul protocollo presentato nel documento che descrive la tecnologia VNp. La Figura 1A è stata generata utilizzando icone di flaticon.com. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università del Kent e finanziato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/T008/768/1 e BB/S005544/1).

Il lavoro batterico intrapreso segue le normative locali, nazionali e internazionali di contenimento della biosicurezza che si addicono al particolare livello di pericolo di biosicurezza di ciascun ceppo.
1. Selezione di reti virtuali diverse
<ol><li>Identificare le sequenze di reti virtuali. NOTA: Per il presente studio, sono state identificate tre sequenze VNp1 che determinano la massima resa e l'esportazione vescicolare delle proteine esaminate fino ad oggi: VNp2, VNp6 e VNp15. Attualmente non è chiaro perché alcune varianti di VNp funzionino in modo più efficiente con alcune proteine rispetto ad altre; pertanto, si raccomanda di generare fusioni tra una nuova proteina di interesse con ogni variante di VNp (ad esempio, VNp2, 6 o 15). VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE I plasmidi che consentono l'espressione della proteina di interesse con diverse fusioni di aminoacidi terminali VNp sono stati resi disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Progettare una strategia di clonazione per inserire il gene di interesse all'estremità 3' del cDNA che codifica per la VNp in uno di questi costrutti, o adattare un plasmide esistente integrando il cDNA sintetizzato della VNp a monte del primo codone ATG del gene che codifica per la proteina di interesse. Utilizzare i metodi descritti alpunto 1.</li>
	<li>Per le proteine tossiche, utilizzare un vettore con un promotore di espressione repressibile o un promotore con rumore di espressione non indotto minimo.</li>
	<li>Clonare il tag della sequenza VNp nel terminale amminico della proteina di fusione. Assicurarsi che i tag di affinità, le sequenze di scissione della proteasi e così via e la proteina di interesse si trovino sul lato carbossilico del tag VNp. Si consiglia di separare la VNp dal peptide a valle con una regione linker flessibile, ad esempio due o tre ripetizioni di una sequenza polipeptidica -G-G-S-G- (Figura 1). NOTA: Utilizzare plasmidi con una selezione antibiotica che non ha come bersaglio il peptidoglicano, che indebolisce la superficie cellulare e riduce la resa delle vescicole. Kanamicina e cloramfenicolo (vedi Tabella dei materiali) sono stati gli antibiotici preferiti utilizzati per questo studio.</li>
</ol>2. Coltura cellulare batterica e induzione proteica
NOTA: I ceppi batterici tipicamente utilizzati in questo protocollo sono Escherichia coli BL21 (DE3) o W3110. Le cellule di E. coli sono coltivate in terreni di brodo lisogeno (LB) (10 g/L di triptone; 10 g/L di NaCl; 5 g/L di estratto di lievito) o in un fantastico brodo (TB) (12 g/L di triptone; 24 g/L di estratto di lievito; 4 mL/L 10% glicerolo; 17 mM KH 2 PO 4; 72mM K2HPO4, sali autoclavati separatamente) (vedi Tabella dei materiali). Immagini di esempio che mostrano ogni fase dell'induzione proteica e il successivo processo di isolamento e purificazione sono mostrate nella Figura 2.
<ol><li>Coltura di 5 mL LB starter da trasformazioni batteriche fresche a 37 °C fino alla saturazione e utilizzarli per inoculare 25 mL di TB in un matraccio conico da 500 ml, il tutto con un'appropriata selezione antibiotica.</li>
	<li>Il rapporto superficie:volume è un fattore importante nell'ottimizzazione di questo sistema. Utilizzare un matraccio di volume il più grande possibile (ad esempio, un matraccio da 5 litri contenente 1 L di coltura; per le tirature di ottimizzazione, utilizzare 25 ml di terreno in un matraccio da 500 ml).</li>
	<li>Incubare le colture di matraccio di agitazione più grandi in un'incubatrice a 37 °C agitando a 200 giri/min (≥25 mm di lancio orbitale) fino a raggiungere un valore di densità ottica di 600 nm (OD600) di 0,8-1,0. NOTA: La vescicolazione è ottimale quando le cellule vengono coltivate a 37 °C. Tuttavia, alcune proteine ricombinanti richiedono espressione a temperature più basse. Se questo è il caso della proteina di interesse, deve essere utilizzato il tag VNp6, in quanto ciò consente l'esportazione di vescicole ad alto rendimento a temperature fino a 25 °C.</li>
	<li>Per indurre l'espressione proteica ricombinante dal promotore T7, aggiungere isopropile β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) ad una concentrazione finale fino a 20 μg/mL (84 μM) (vedere Tabella dei materiali). L'induzione dell'espressione proteica ricombinante deve avvenire nella fase tardiva (cioè OD600 tipico di 0,8-1,0) per la produzione di vescicole. NOTA: La durata del periodo di induzione può differire tra le proteine, con alcune che raggiungono la massima produzione a 4 ore e altre durante la notte (18 ore). Ad oggi, la massima esportazione di vescicole è stata ottenuta in colture notturne.</li>
</ol>3. Isolamento delle vescicole ricombinanti
<ol><li>Pellettare le celle mediante centrifugazione a 3.000 x g (4 °C) per 20 minuti.</li>
	<li>Per sterilizzare i terreni contenenti vescicole per la conservazione a lungo termine, far passare i terreni di coltura eliminati attraverso un filtro in polietersulfone (PES) sterile e privo di detergenti (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Per verificare l'esclusione di cellule vitali dal filtrato contenente vescicola, placcare su agar LB e incubare per una notte a 37 °C.</li>
	<li>Per concentrare le vescicole in un volume più piccolo, far passare il mezzo sterile contenente vescicola attraverso un filtro sterile e privo di detergenti da 0,1 μm di esteri misti di cellulosa (MCE) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Lavare delicatamente la membrana con 0,5-1 ml di PBS sterile utilizzando un raschietto cellulare o uno spargitore di plastica per rimuovere accuratamente le vescicole dalla membrana. Trasferire in un tubo di microfuge fresco. NOTA: Le vescicole purificate possono essere conservate in mezzi sterili o in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) a 4 °C. Ci sono esempi di proteine ricombinanti immagazzinate in queste vescicole per 6 mesi, in questo modo, senza perdita di attività enzimatica.</li>
</ol>4. Rilascio di proteine solubili da vescicole isolate
<ol><li>Una volta che le vescicole contenenti proteine sono state isolate nel mezzo sterile/tampone, sottoporre le membrane lipidiche vescicolari alla sonicazione utilizzando uno schema appropriato per l'apparecchio (ad esempio, cicli di accensione e spegnimento 6x 20 s) e centrifugare a 39.000 x g (4 °C) per 20 minuti per rimuovere i detriti delle vescicole. NOTA: Lo shock osmotico o il trattamento detergente possono essere utilizzati come alternativa per aprire le vescicole, ma è necessario considerare l'impatto sulla funzionalità proteica e/o sull'applicazione a valle.</li>
	<li>Se la fusione di VNp rimane citosolica e non viene rilasciata nei media, isolare la proteina utilizzando protocolli standard (ad esempio, risospendere i pellet cellulari in 5 ml di un tampone di estrazione appropriato (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonicare e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione).</li>
</ol>5. Determinazione della concentrazione proteica
<ol><li>Determinare la concentrazione di proteine mediante analisi densitometrica su gel di campioni triplicati1. Eseguire insieme agli standard di caricamento dell'albumina sierica bovina (BSA) su gel di elettroforesi su gel di dodecil-solfato di sodio colorato con coomassie (SDS-PAGE). Scansionare e analizzare i gel utilizzando un software appropriato (ad esempio, Immagine J; vedi Tabella dei materiali).</li>
</ol>6. Visualizzazione della formazione di vescicole e vescicole isolate mediante microscopia a fluorescenza
NOTA: Se le cellule contengono marcatori di fusione o membrana VNp marcati in modo fluorescente, è possibile utilizzare l'imaging di cellule vive per seguire la formazione di vescicole. In alternativa, i coloranti lipidici fluorescenti possono essere utilizzati per visualizzare le vescicole per confermare la produzione e la purificazione.
<ol><li>Montaggio a celle<ol><li>Indurre l'espressione di fusione della rete virtuale per diverse ore prima di essere montato sul vetrino.</li>
		<li>Metodo del tampone di agarosio (Figura 3A-C): pipettare le cellule su un sottile (<1 mm), circolare LB-agarosio (2%) che è stato lasciato formare e impostare su un vetrino pulito. Lasciare che le celle si depositino ed equilibrarsi e posizionare un coprislip di 50 mm x 25 mm sul pad e sulle celle. Tenere il coprislip in posizione con distanziali e nastro adesivo.</li>
		<li>Metodo del polietilenimmina (PEI) (Figura 3D-F): distribuire 20 μL di PEI allo 0,05% (in dH2O) su un vetrino con punta di pipetta e lasciare legare per 3-5 minuti al vetro senza lasciare asciugare. Aggiungere 50 μL di coltura cellulare e lasciare agire per 5-10 minuti per assicurarsi che i batteri si siano associati alla superficie rivestita di PEI4. Lavare il vetrino con 100 μL di supporto prima di posizionarlo sul vetrino e tenerlo in posizione con distanziali e nastro adesivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Vescicole di montaggio<ol><li>Vescicole purificate con pipetta su un sottile tampone circolare LB-agarosio (2%) (<1 mm) che è stato lasciato formare e impostare su un vetrino pulito. Una volta che il liquido si è asciugato, posizionare un coprislip di 50 mm x 25 mm sul tampone e sulle vescicole. Tenere il coprislip in posizione con distanziali e nastro adesivo.</li>
		<li>Il colorante lipidico fluorescente FM4-64 è in grado di colorare le membrane5 e quindi può essere utilizzato per visualizzare le vescicole. Aggiungere FM4-64 (vedere Tabella dei materiali) alle vescicole purificate ad una concentrazione finale di 2 μM (da uno stock di 2 mM disciolto in dimetilsolfossido [DMSO]) e ottenere l'immagine dopo un'incubazione di 10 minuti. Ciò è particolarmente utile per identificare le vescicole contenenti carichi marcati in modo non fluorescente5.</li>
		<li>Risciacquare i vetrini con lo stesso mezzo utilizzato per coltivare le cellule osservate. NOTA: Alcuni mezzi complessi (ad esempio, TB) possono presentare autofluorescenza, che può causare un eccesso di segnale di fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Vescicole di imaging NOTA: immagini di microscopia di esempio di vescicole ricombinanti di VNp possono essere visualizzate nella Figura 4.<ol><li>Montare il vetrino su un microscopio invertito (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un obiettivo ad immersione in olio e lasciare agire per 2-3 minuti per consentire al campione di depositarsi e alla temperatura di equilibrarsi. NOTA: Tutte le immagini di cellule vive per ciascun campione devono essere completate entro 30 minuti dal montaggio delle celle sui vetrini di copertura per ridurre al minimo l'impatto della fototossicità e dello stress anaerobico. Per questo motivo, le immagini a piano singolo sono preferite agli z-stack.</li>
		<li>Utilizzare sorgenti luminose appropriate (ad esempio, diodi emettitori di luce [LED] o lampadina alogena; vedi tabella dei materiali) e combinazioni di filtri per le proteine/coloranti fluorescenti utilizzate6.</li>
		<li>Utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento (cioè 100x o 150x) e ad alta apertura numerica (cioè NA ≥1,4) per l'imaging delle cellule microbiche e delle vescicole.</li>
		<li>Determinare l'intensità luminosa minima necessaria per visualizzare i segnali di fluorescenza provenienti da cellule e / o vescicole. Ciò potrebbe richiedere alcune regolazioni delle impostazioni di esposizione e guadagno per la fotocamera in uso. NOTA: i tempi di esposizione tipici delle attuali telecamere CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) variano tra 50 e 200 ms a seconda del sistema di imaging.</li>
		<li>Per le immagini a fotogramma singolo, usate la media di tre immagini per ridurre il rumore di fondo casuale dipendente dall'hardware.</li>
		<li>Per l'imaging time-lapse, consentire 3-5 minuti tra i singoli fotogrammi. NOTA: A seconda della configurazione del microscopio, potrebbe essere necessario regolare la messa a fuoco in modo intermittente durante esperimenti time-lapse più lunghi.</li>
	</ol></li>
</ol>

Produzione e imaging di vescicole ricombinanti piene di proteine da E. coli

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Il metodo amino-terminale peptide-marcato per la produzione di proteine ricombinanti sopra descritto è un processo semplice, che produce costantemente grandi quantità di proteine che possono essere efficacemente isolate e / o conservate per mesi.
È importante evidenziare i passaggi chiave del protocollo necessari per un uso ottimale di questo sistema. In primo luogo, il tag VNp1 deve trovarsi al terminale N, seguito dalla proteina di interesse e da eventuali tag appropriati. È anche importante evitare l'uso di antibiotici che colpiscono lo strato di peptidoglicano, come l'ampicillina.
In termini di condizioni di crescita, sono necessari terreni ricchi (ad esempio, supporti LB o TB) e un elevato rapporto superficie:volume per massimizzare la produzione di vescicole. La temperatura ottimale per la produzione di vescicole extracellulari è di 37 °C, ma devono essere considerate anche le condizioni tipicamente richieste per l'espressione della proteina di interesse. Per temperature di induzione più basse, è necessario utilizzare VNp6. Fondamentalmente, l'induzione del promotore T7 deve essere ottenuta utilizzando IPTG non superiore a 20 μg / mL (84 μM) una volta che le cellule raggiungono un OD600 di 0,8-1,0. Le proteine espresse utilizzando il sistema raggiungono la massima produzione di vescicole a 4 ore o dopo induzione notturna.
Nonostante la semplicità di questo protocollo, richiede ottimizzazione. La fusione delle varianti VNp, le temperature di espressione e i periodi di tempo di induzione possono variare a seconda della proteina di interesse. Inoltre, vi è la necessità di ottimizzare la purificazione e la successiva concentrazione delle vescicole extracellulari dai mezzi. La procedura corrente non è scalabile e può richiedere molto tempo. Questi sono i limiti di questa metodologia.
La tecnologia VNp presenta molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali2. Permette l'esportazione vescicolare di diverse proteine, con la dimensione massima espressa con successo fino ad oggi di 175 kDa per le vescicole che rimangono interne e 85 kDa per quelle che vengono esportate. Inoltre, questa tecnologia può aumentare significativamente la resa di proteine ricombinanti con una serie di proprietà fisiche e attività. Le vescicole esportate contenenti la proteina di interesse possono essere isolate mediante semplice filtrazione dai terreni precleared e possono essere successivamente conservate, in terreni di coltura sterili o tampone, a 4 °C per diversi mesi.
Le applicazioni di questo sistema sono diverse, dalla scienza delle scoperte alla biotecnologia applicata e alla medicina (ad esempio, attraverso la produzione di terapie funzionali)3. La facilità di produzione, la lavorazione a valle e l'alto rendimento sono tutte qualità interessanti in questi settori e soprattutto nell'industria.

Il batterio Gram-negativo E. coli è un sistema interessante per la produzione di proteine ricombinanti sia su scala industriale che accademica. Non è solo conveniente e semplice da coltivare in lotti ad alta densità, ma è stato stabilito un ampio spettro di reagenti, ceppi, strumenti e promotori per promuovere la generazione di proteine funzionali in E. coli1. Inoltre, le tecniche di biologia sintetica stanno ora superando gli ostacoli tipicamente legati all'applicazione di modifiche post-traduzionali e al ripiegamento di proteine complesse2. La capacità di indirizzare la secrezione di proteine ricombinanti nei terreni di coltura è interessante per migliorare la resa e ridurre i costi di produzione. Il confezionamento controllato di proteine definite dall'utente in vescicole di membrana assiste lo sviluppo di prodotti e tecnologie nell'ambito della biotecnologia applicata e dell'industria medica. Fino ad ora, c'è stata una mancanza di metodi ampiamente applicabili per secernere proteine ricombinanti da E. coli 3.
Eastwood et al. hanno recentemente sviluppato un metodo basato sul tagging dei peptidi per produrre e isolare vescicole ricombinanti contenenti proteine da E. coli1. Questo peptide Nucleante Vescicole (VNp) consente la produzione di vescicole di membrana batterica extracellulare, in cui la proteina ricombinante di scelta può essere mirata per semplificare la purificazione e lo stoccaggio della proteina bersaglio, e consente rese significativamente più elevate di quelle normalmente consentite dalle colture di fiaschetta agitate. Sono state riportate rese di quasi 3 g di proteine ricombinanti per litro di coltura in fiaschetta, con rese >100 volte superiori rispetto a quelle ottenute con proteine equivalenti prive del tag VNp. Queste vescicole ricombinanti arricchite di proteine possono essere rapidamente purificate e concentrate dai terreni di coltura e forniscono un ambiente stabile per la conservazione. Questa tecnologia rappresenta un importante passo avanti nella produzione di proteine ricombinanti di E. coli. Le vescicole compartimentano proteine contenenti legami tossici e disolfuro in forma solubile e funzionale e supportano la purificazione semplice, efficiente e rapida di proteine funzionali confezionate in vescicola per la conservazione a lungo termine o la lavorazione diretta1.
I principali vantaggi che questa tecnologia presenta rispetto alle tecniche attuali sono: (1) l'applicabilità a una gamma di dimensioni (da 1 kDa a >100 kDa) e tipi di proteine; (2) facilitare la formazione di disolfuro inter- e intra-proteico; (3) applicabile ai complessi multiproteici; (4) può essere utilizzato con una gamma di promotori e ceppi standard di E . coli da laboratorio; 5) la generazione di rese di proteine da matraccio di agitazione normalmente osservate solo con colture di fermentazione; le proteine vengono esportate e confezionate in vescicole legate alla membrana che (6) forniscono un ambiente stabile per la conservazione della proteina solubile attiva; e (7) semplifica il trattamento a valle e la purificazione delle proteine. Questo strumento di proteine ricombinanti semplice ed economico avrà probabilmente un impatto positivo sulle industrie biotecnologiche e mediche, nonché sulla scienza delle scoperte.
Qui, un protocollo dettagliato, sviluppato nel corso di diversi anni, descrive le condizioni ottimali per produrre vescicole ricombinanti piene di proteine dai batteri con la tecnologia VNp. Vengono mostrate immagini di esempio di questo sistema nella pratica, con una proteina fluorescente che viene espressa, consentendo di visualizzare la presenza di vescicole durante le diverse fasi della produzione, purificazione e concentrazione. Infine, vengono fornite indicazioni su come utilizzare l'imaging cellulare vivo per convalidare la produzione di vescicole contenenti fusione VNp dai batteri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

Questo sistema innovativo, che utilizza un breve tag peptidico, che esporta più proteine ricombinanti in vescicole legate alla membrana da E. coli, fornisce una soluzione efficace a una serie di problemi associati all'espressione batterica delle proteine ricombinanti. Queste vescicole ricombinanti compartimentano le proteine all'interno di un microambiente che facilita la produzione di proteine contenenti batteri altrimenti impegnative, tossiche, insolubili o contenenti disolfuro. La resa proteica è aumentata considerevolmente rispetto alla tipica espressione batterica in assenza del tag peptidico vescicola-nuclea. Il rilascio di proteine confezionate in vescicola supporta l'isolamento dal terreno di coltura e consente l'immagazzinamento attivo delle proteine a lungo termine. Questa tecnologia dà luogo a maggiori rese di proteine funzionali confezionate in vescicola per una lavorazione a valle semplificata per una vasta gamma di applicazioni, dalla biotecnologia applicata alla scienza delle scoperte e alla medicina. Nel presente articolo e nel video associato, viene fornito un protocollo dettagliato del metodo, che evidenzia i passaggi chiave della metodologia per massimizzare la produzione di vescicole riempite di proteine ricombinanti.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

Autore in primo piano: La produzione di proteine ricombinanti 

Produzione e analisi ottimizzate di vescicole ricombinanti piene di proteine da E. coli

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli contenente il costrutto di espressione VNp6-mNeongreen è cresciuto fino alla fase tardiva di log (Figura 2A). L'espressione di VNp6-mNeongreen è stata indotta dall'aggiunta di IPTG alla coltura (concentrazione finale di 20 μg/mL o 84 μM), che è stata successivamente lasciata crescere durante la notte a 37 °C con scuotimento vigoroso (200 rpm, lancio orbitale di ≥25 mm). La mattina seguente, la coltura ha mostrato la fluorescenza mNeongreen7 (Figura 2B), che è rimasta visibile nei mezzi dopo la rimozione delle cellule batteriche mediante centrifugazione (Figura 2C). La presenza di VNp-mNeongreen all'interno della coltura e dei terreni di coltura eliminati è stata confermata da SDS-PAGE (Figura 2D). Le vescicole contenenti mNeongreen sono state isolate su un filtro MCE da 0,1 μm (Figura 2E) e risospese in PBS (Figura 2F). Le vescicole purificate sono state successivamente montate su un tampone di agarosio (Figura 3A-C) e ripresi utilizzando la microscopia a fluorescenza a largo campo (Figura 4A). La presenza di membrane vescicolari è stata confermata utilizzando il colorante fluorescente lipofilo FM4-64 (Figura 4B). Le cellule di E. coli che esprimono la proteina della membrana interna CydB fusa con mNeongreen (verde) e VNp6-mCherry2 (magenta)8 mostrano la produzione di vescicole e l'inserimento del carico in cellule batteriche vive (Figura 4C). La Figura 4A,B è stata catturata utilizzando un microscopio a fluorescenza a largo campo, mentre la Figura 4C è stata acquisita utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM), utilizzando i metodi descritti in precedenza 9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> Figura 1: Riepilogo della tecnologia VNp dalla progettazione di una strategia di clonazione alla purificazione e conservazione delle vescicole extracellulari . (A) Schema di una tipica proteina di fusione VNp. VNp al terminale NH2, seguito da un linker flessibile e da una combinazione appropriata di tag di affinità e fluorescenza (Tag1, Tag 2, sito di scissione della proteasi [ad esempio, TEV]) e proteina di interesse. (B) Diagramma schematico che riassume il protocollo per l'espressione e la purificazione di vescicole di membrana riempite di proteine ricombinanti da E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> Figura 2: Fasi di produzione e purificazione delle vescicole VNp6-mNg. Colture di cellule di E. coli contenenti l'espressione di VNp-mNeongreen costrutto in luce blu prima (A) o dopo (B) l'espressione indotta da IPTG della proteina di fusione. Le cellule di (B) sono state rimosse mediante centrifugazione, lasciando vescicole riempite di VNp-mNeongreen nei mezzi (C). (D) Campioni equivalenti da A, B e C sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione coomassie. Le vescicole sono state isolate su un filtro da 0,1 μm (E) e successivamente lavate via in un volume appropriato di tampone (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> Figura 3: Procedura di montaggio delle cellule per l'imaging delle vescicole e la produzione di vescicole. (A-C) Il metodo del tampone di agarosio e (D-F) il metodo PEI per il montaggio delle cellule di E. coli sul vetrino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> Figura 4: Immagini al microscopio di vescicole ricombinanti di VNp. Immagini di emissione verdi (A) e rosse (B) da diversi campi di vescicole contenenti VNp6-mNeongreen marcate con FM4-64 montate su un cuscinetto di agarosio. (C) L'imaging delle cellule di E. coli che esprimono la proteina della membrana interna CydB fusa a mNeongreen (verde) e VNp6-mCherry2 (magenta) mostra la produzione di vescicole e l'inserimento del carico in cellule batteriche vive. (A,B) sono state riprese utilizzando un microscopio a fluorescenza a largo campo, mentre (C) è stata acquisita utilizzando la microscopia a illuminazione strutturata (SIM). Barre della scala: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Il presente protocollo descrive un metodo dettagliato per la produzione batterica di proteine ricombinanti, comprese proteine tipicamente insolubili o contenenti disolfuro, confezionate all'interno di vescicole extracellulari legate alla membrana. Ciò ha il potenziale per essere applicato a settori versatili della ricerca scientifica, tra cui la biotecnologia applicata e la medicina.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Stiamo cercando di capire le interazioni dinamiche tra le molecole all'interno delle cellule viventi. Per l'analisi biochimica, può essere necessario utilizzare grandi quantità di proteine ricombinanti. Questi possono essere estremamente difficili da esprimere in una forma correttamente piegata e funzionale.Se una proteina risultasse mal ripiegata o insolubile quando espressa nei batteri, i ricercatori dovrebbero ricorrere a cellule di mammifero, che è costoso e relativamente lento, o utilizzare polipeptidi sintetici. Il nostro protocollo consente un'elevata espressione di resa e l'esportazione di proteine impegnative da E.coli. L'aggiunta di una breve sequenza peptidica scissabile al terminale amminico della proteina non solo migliora la produzione e la resa di ogni proteina che abbiamo testato fino ad oggi, ma esporta anche la proteina dalla cellula nei media.Oltre a semplificare l'espressione proteica, semplifica anche la purificazione delle proteine a valle.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K Views.  University of Kent. Stiamo cercando di capire le interazioni dinamiche tra le molecole all'interno delle cellule viventi. Per l'analisi biochimica, può essere necessario utilizzare grandi quantità di proteine ricombinanti. Questi possono essere estremamente difficili da esprimere in una forma correttamente piegata e funzionale.Se una proteina risultasse mal ripiegata o insolubile quando espressa nei batteri, i ricercatori dovrebbero ricorrere a cellule di mammifero, che è costoso e relativamente lento,...

Video: Autore in primo piano: La produzione di proteine ricombinanti 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Ricerca

Biologia

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

Isolamento vescicolare ricombinante da coltura batterica per rilasciare proteine solubili

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.