Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust sovvenzione WT091939MA. Alain Filloux è sostenuta dalla Royal Society.

1. Ceppi batterici e Culture <ol><li> Ingegnere una cellula di Escherichia coli destinatario (Prey, P), trasformando (utilizzando standard di CaCl 2 trattamento o elettroporazione) 15 E. coli DH5a cellule con un plasmide permette l&#39;a-complementazione del gene lacZ (Tabella 1). Piastra le cellule trasformate di Luria-Bertani piastre di agar (LBA, 1,5% agar) contenente 5-bromo-4-cloro-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal) a 40 mg / ml concentrazione finale e antibiotico appropriato. Incubare a 37 ° C durante la notte e la mattina seguente per selezionare trasformanti blu (vedi § 1.3). </li><li> Crescere le cellule donatrici Pseudomonas aeruginosa che sono T6SS-attiva (D +) o T6SS-inattivo (D-) (Tabella 1) per tutta la notte LBA a 37 ° C. Nell&#39;esempio qui presentato è stato utilizzato un P. RET aeruginosa ceppo possessoun H1-T6SS costitutivamente attivo 16 ed un mutante isogenico con una delezione della H1-T6SS cluster genico (Tabella 1). </li><li> Il giorno successivo, preparare un liquido di coltura durante la notte in matraccio aerato inoculando un clone blu luminoso tra la E. trasformanti coli (P) dalla piastra descritto in § 1.1, in 5 ml di Tryptic Soy Broth (TSB) integrato con l&#39;antibiotico appropriato. Crescere sotto agitazione a 37 ° C. Procedere anche con una singola colonia di (D +) e di (D -) dalla piastra descritto in § 1.2. </li></ol> 2. Concorso Saggio <ol><li> Preparare piatti LBA per l&#39;esperimento giorno successivo. Assicurarsi che questi piatti è asciugato correttamente (sia vicino al becco Bunsen o in cabinet a flusso laminare). Preparare un &quot;test di ingresso&quot; (A-Input) Piastra per i ceppi (D +), (D -) e (P </strong&gt;). Preparazione di un &quot;Assay-output&quot; (A-output) piastra per i ceppi (D - P +) e (D + + P). Dividere ed etichettare le piastre di conseguenza. </li><li> Dopo una crescita overnight (cfr. § 1.3), misurare la densità ottica (OD 600nm) della coltura batterica di ingresso (D -, D + e P) e calcolare il volume richiesto per ottenere una densità cellulare equivalente ad 1 unità OD 600nm di ogni ceppo . Ogni coltura cellulare &quot;input&quot; (D -, D + e P) è inizialmente raccolto in un contenitore sterile da 1,5 ml provette Eppendorf. </li><li> Centrifugare i campioni batterici a 13.000 rpm per 1 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di D -, D + culture, e P, in 100 ml di fresca TSB pipettando dolce e inoculare 10 ml di ciascuna corricorrispondente ceppo come una singola applicazione sulla piastra &quot;A-input&quot; (preparato in § 2.1). </li><li> Inoculare la piastra &quot;A-output&quot; (preparato in § 2.1). Più precisamente, mescolare delicatamente 30 ml di (D +) con 30 microlitri (P) e 30 pl di (D -) con 30 ml (P) in due tubi separati Eppendorf (nota che le colture usate sono quelle descritte in § 2.4) . Inoculare 20 microlitri della miscele (D + / P) e (D - / P) come punti singoli sulla piastra &quot;A-output&quot;. Lasciare le macchie asciugare vicino un becco Bunsen e posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per un adeguato periodo di tempo durante il quale l&#39;uccisione batterica avviene. Nel caso di P. aeruginosa, un delitto d&#39;efficiente batterica si osserva dopo 5 ore di incubazione quando si confrontano un T6SS attivi con un ceppo T6SS difettoso. </li></ol> 3. Osservazione qualitativa di tRapina a mano armata ha batterica <ol><li> Preparare lastre LBA contenenti 40 pg / ml di X-gal per la lettura del saggio. Le piastre si chiamerà &quot;ingresso Lettura&quot; o &quot;R-input&quot; per individuare i batteri isolati o &quot;uscita Lettura&quot; o &quot;R-output&quot; per individuare miste colture batteriche e quindi leggere le prestazioni uccidere. Queste piastre devono anche essere adeguatamente essiccata. Dividere il piatto in quattro parti uguali sulla sua schiena e annotare queste parti 0, 10 -1, 10 -2 e 10 -3, che designa le diluizioni di coltura batterica per individuare le piastre di agar (vedi § 3.3). La diluizione consentirà una valutazione semi-quantitativa del blu / bianco rapporto di batteri all&#39;interno del punto stesso. </li><li> Raccogliere con un&#39;ansa sterile le macchie singole batterica dalla piastra &quot;A-input&quot; (vedi § 2.4) e &quot;A-output&quot; piastra (vedi § 2.5) e risospendere ogni punto in distinte da 1,5 ml provette Eppendorf contenenti 1 ml di TSB. Mettere in un agitatore Eppendorf blocco durante 30 minuti per risospendere in modo efficiente ilbatteri. </li><li> Preparare una serie di 5 volte 3 provette Eppendorf contenente 900 ml di TSB e procedere per ciascuna macchia risospeso a dieci diluizioni seriali fino a 10 -3. Assicurarsi di modificare i puntali per pipette e il vortex 5 secondi tra ogni fase di diluizione. </li><li> Procedere alla individuazione delle diluizioni batteriche preparate in § 3.3 a ben secchi LBA piastre contenenti 40 mg / ml di X-gal iniziando con la più diluita alla sospensione non diluito, rendendo questi i &quot;R-input&quot; piastre per la &quot;A -input &quot;macchie e le&quot; R-uscita &quot;per i piatti&quot; A-&quot;punti di uscita (Figura 2). Vortex brevemente ogni tubo prima di procedere alla individuazione di mantenere una sospensione omogenea batterica. Per la riproducibilità dei risultati, posto 20 pl in triplicato all&#39;interno di un quadrante (Figura 2). La secchezza relativa del piatto è importante in questa fase, in quanto i punti devono rimanere separati singolarmente sul piatto e non scivolare verso l&#39;altro. Una quantificazione del saggio di competizione è anche possibile in questa fase dell&#39;esperimento. Dopo la fase 3.3, diffuso 100 ul della diluizione 10 -3 LBA su piastre contenenti 40 mg / ml di X-gal. Per la riproducibilità dei risultati, procedere ad una placcatura in triplicato per ogni punto della piastra &quot;A-output&quot;. Posizionare le piastre di diluizione in un incubatore ° C durante la notte (corrispondente a 16 ore di incubazione) 37. Procedere al conteggio delle colonie blu (le cellule P che sono rimasti in vita). Risultati tipici ottenuti dopo 5 ore di competizione sono mostrati in Figura 3. </li><li> Lasciare aperta la piastra (senza coperchio) all&#39;interno di una zona sterile per consentire l&#39;assorbimento del liquido in eccesso all&#39;interno di ciascun punto. </li><li> Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C durante la notte. Durante questo periodo di incubazione, l&#39;uccisione è ancora in corso nel mix (D + / P) in quanto entrambi i ceppi sono ancora in contatto. </li><li> Scattare una fotoo acquisire le piastre per l&#39;analisi di uscita (figura 2). Dove i punti restano in gran parte blu indica che E. coli non è stato ucciso da P. aeruginosa. Questo è il caso in cui E. coli viene miscelato con un T6SS-difettoso P. aeruginosa ceppo (D-) (Figura 2, piastra in basso a destra). </li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il metodo presentato in questo articolo permette una osservazione visiva di T6SS mediata da attività battericida / bacteriostasis. Il test viene eseguito sulla superficie di una piastra di agar. È stato precedentemente dimostrato che T6SS-dipendente uccisione saggio eseguito con liquido di coltura batterica mista non è efficiente, probabilmente a causa della mancanza di contatto stabile tra i due batteri 8. Il T6SS è creduto per funzionare con un meccanismo simile a quello utilizzato da batteriofagi per iniettare DNA nelle cellule bersaglio 17. In coltura liquida, il tubo-come la struttura del T6SS può rompere più facilmente, inter-batterica contatto può essere perso, e le tossine non sono efficientemente consegnati. In termini di tempi di incubazione, le 5 prime ore di contatto che ci descrivono la tensione tra donatore e la preda è sufficiente osservare l&#39;uccisione dei batteri tra P. aeruginosa e E. coli, come illustrato in figura 3 </strong&gt;. Tuttavia, è opportuno regolare il tempo di incubazione eseguendo una cinetica al fine di ottimizzare le condizioni sperimentali. Poiché questo metodo è una tecnica basata colore, i risultati di uscita può essere compromessa dalla pigmentazione del ceppo donatore. Per esempio, nel caso di P. aeruginosa, alcuni ceppi producono alti livelli di pigmenti colorati come piocianina e pyoverdine, che possono interferire con la lettura del saggio, rendendo la distinzione dalla preda relativamente difficile. Altri cromogeni β-galattosidasi substrati, come il magenta-gal o il rosso-gal, può essere usato al posto di X-gal (Tabella 1). Il saggio di competizione può fare uso di altri geni reporter per la lettura. Per esempio, analisi analoga è stata eseguita utilizzando la proteina verde fluorescente marcato prede 12. La nostra analisi, pur non quantitativa, fornisce una buona indicazionedell&#39;attività T6SS poiché si basa sulla sopravvivenza o l&#39;uccisione di una preda reporter. Questa tecnica presenta il vantaggio di essere facile e conveniente per valutare l&#39;attività battericida / bacteriostasis di T6SSs da qualsiasi specie batteriche. Finora, l&#39;attività del T6SS ha dimostrato contro batteri Gram-negativi e non chiaro esempio di T6SS sensibili batteri Gram-positivi è stato segnalato ancora 12. È anche ovvio che l&#39;incompatibilità nella cultura delle diverse specie batteriche (ad esempio la crescita temperatura, ossigenazione, supporti specifici) è da considerare. La nostra analisi può anche essere utilizzato per valutare quali componenti T6SS sono assolutamente essenziale poiché anche tracce di una tossina secreta potrebbe essere sufficiente per uccidere la preda. Anche debole attività dei T6SS potrebbe quindi chiaramente essere rilevato dalla nostra analisi, rispetto al normale di test procedura T6SS-dipendente della secrezione con blot supernatante di coltura e occidentaleanalisi. Tuttavia, una corretta unità formanti colonie (CFU) conteggio è ancora necessaria per quantificazione accurata di questa attività T6SS.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RET (D +) (T6SS attivi) </td><td> Lab ceppo </td><td></td><td> Descritto in riferimento 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RET Δ H1-T6SS (D -) (T6SS inattivi) </td><td> Questo studio </td><td></td><td> L&#39;H1-T6SS cluster (che comprende i geni PA0070 a PA0095) è stato cancellato dallo scambio allelico seguendo la procedura descritta nel Manuale 18. Il frammento mutatore è stato generato con il seguente set di primer: I primer frammento Up: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, e 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. I primer frammento di Down: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5a </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 A1 fine hsd R17 (r k -, k + m) pho A supporto E44 λ-thi -1 Gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Questo vettore esprime il peptide di α β-galattosidasi utilizzato per α-complementazione. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Utilizzare a 40 mcg / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck-chimici </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (caseina di soia brodo) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex shaker Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 cellulare densimetro </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> La ricerca Organics </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Strain, plasmide, materiali e reagenti utilizzati. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

Sistemi di secrezione di tipo VI (T6SSs) sono nanomacchine molecolari permettendo batteri Gram-negativi per trasportare e iniettare proteine ​​in una varietà di cellule bersaglio 1,2. Il T6SS è composto da 13 componenti di base e mostra somiglianze strutturali con la coda-tubo di batteriofagi 3. Il fago utilizza un tubo e un dispositivo di puntura di penetrare dell&#39;involucro cellulare di batteri bersaglio e iniettare DNA. Si propone che il T6SS è un dispositivo batteriofago invertita creando un percorso specifico nella busta cellula batterica guidare effettori e tossine alla superficie. Il processo potrebbe proseguire e il dispositivo potrebbe perforare T6SS altre cellule con cui il batterio è in contatto, quindi iniettare gli effettori in questi obiettivi. Il tubo di coda e parti punzonamento dei dispositivi dei T6SS sono realizzati con Hcp e proteine ​​VgrG, rispettivamente, 4,5. La versatilità del T6SS è stata dimostrata attraverso sTUDI utilizzando vari batteri patogeni. Le T6SS Vibrio cholerae può rimodellare citoscheletro delle cellule ospite eucariotiche iniettando un VgrG &quot;evoluto&quot; portando un C-terminale actina reticolazione domini 6,7. Un altro esempio lampante è stato recentemente documentato con Pseudomonas aeruginosa, che è in grado di colpire e uccidere i batteri in un T6SS-dipendente, quindi, favorire la creazione di batteri in nicchie microbiche specifiche e il contesto concorrenziale 8,9,10. In quest&#39;ultimo caso, tre T6SS-proteine ​​secrete, cioè Tse1, Tse2 TSE3 e sono state identificate come le tossine iniettati nei batteri bersaglio (Figura 1). La cellula donatrice è protetta dagli effetti deleteri di questi effettori attraverso un meccanismo anti-tossina, mediato da proteine ​​di immunità TSI1, TSI2 e Tsi3 8,9,10. Questa attività antimicrobica può essere monitorata quando T6SS-abili batteri sono co-coltivati ​​su sOlid superfici in competizione con altre specie batteriche o con T6SS-inattivi i batteri della stessa specie 8,11,12,13. I dati disponibili hanno sottolineato un approccio numerico al saggio di competizione batterica, anche in termini di tempo di conteggio CFU che dipende in gran parte produttori di antibiotici. Nel caso di ceppi resistenti agli antibiotici come P. aeruginosa, questi metodi possono essere appropriati. Inoltre, con l&#39;identificazione di circa 200 differenti loci T6SS in più di 100 genomi batterici 14, uno strumento di screening conveniente è altamente desiderabile. Abbiamo sviluppato un saggio che è facile da usare e richiede materiale standard di laboratorio e reagenti. Il metodo offre una tecnica rapida e qualitativa per monitorare la T6SS-dipendente battericida / bacteriostasis attività utilizzando un ceppo reporter come una preda (in questo caso Escherichia coli DH5a) permettendo a-complementazione del gene lacZ. Nel complesso, questo metodo è graphic e permette la rapida identificazione di T6SS legati fenotipi su piastre di agar. Questo protocollo sperimentale può essere adattato ad altri ceppi o specie batteriche tenendo conto delle condizioni specifiche come mezzi di crescita, la temperatura o il tempo di contatto.

Risultati tipici sono mostrati in figura 1 con i ceppi e reagenti descritti nella Tabella 1. Le piastre mostrate in questa figura sono stati analizzati dopo una notte di incubazione. Le &quot;Lettura-Input&quot; piatti mostrano un modello di serie di diluizione per i ceppi utilizzati in questa analisi. Come previsto, la E. coli preda punti (P) iperespressione del gene lacZ appaiono blu su un supporto integrato con X-gal, mentre il donatore P. ceppi aeruginosa (D +, T6SS attivo) e (D -, inattivo T6SS) rimangono bianco. Le &quot;Lettura-output&quot; piatti in cui il mix tra la preda e un ceppo T6SS attivo (D + / P) è stata avvistata mostrano la scomparsa del blu preda indicando così che è stato ucciso. Questo dimostra la capacità del donatore per competere con la preda. La persistenza del colore blu sulla (D - / P) piastra dimostra l&#39;incapacità di un donatore T6SS inattivo per uccidere la preda blu. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Uccisione di E. coli di T6SS-abile P. aeruginosa. P. aeruginosa inietta tossine nel E. coli in una cellula bersaglio T6SS-dipendente (indicato dalla freccia bianca). Due tossine Tse1 e TSE3 (arancione e cerchi rossi) sono iniettati nel E. coli periplasma e degradare il peptidoglicano 9. La tossina Tse2 (cerchio giallo) viene iniettato nella E. coli citoplasma ed ha una attività batteriostatica 8,10. L&#39;azione combinata delle tossine uccide le cellule bersaglio (lampo e del cranio). La sopravvivenza delle cellule bersaglio può essere rilevata monitorando l&#39;attività del prodotto β-galattosidasi (vedi anche figura 2). P. uneruginosa è protetto contro l&#39;attività delle tossine dalle proteine ​​immunità TSI1, TSI2 e Tsi3 (arancio, quadrati gialli e rossi, rispettivamente) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Figura 2. Piastra di saggio Agar per monitorare T6SS-dipendente uccisione batterica In questa figura sono mostrati nella parte superiore dei &quot;Lettura-Input&quot; come piastre delle diluizioni seriali del D -., D +, e le celle di input P. Le celle di immissione P sono blu dovuto alla α-complementazione del gene lacZ e dunque a β-galattosidasi che taglia X-gal. Nella parte inferiore viene visualizzata la &quot;Lettura-uscita&quot; piastre delle diluizioni seriali del mix batterica tra un attivo (D + / P) </strong&gt;, o un inattivo (D - / P), T6SS donatore P. aeruginosa con il ceppo E. coli preda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Quantificazione della uccisione di E. coli di P. aeruginosa dopo 5 ore di incubazione. Il grafico presenta il conteggio di E. CFU coli descritto nel punto 3.4. I risultati qui presentati mostrano un 3-fold differenza tra il T6SS + e le T6SS-ceppi, suggerendo che la maggior parte della uccisione avviene durante le prime 5 ore di contatto.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Descriviamo un dosaggio qualitativo per monitorare la concorrenza batterica mediata dalla<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Sistema di secrezione di tipo VI (T6SS). Il saggio si basa sulla sopravvivenza / uccisione di cellule di Escherichia coli che trasportano un bersaglio<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Questa tecnica è regolabile per valutare l&#39;attività battericida / bacteriostasis di T6SS-abili microrganismi.

Un test per il monitoraggio visivo T6SS-mediata Concorso batterica

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  Imperial College London. Descriviamo un dosaggio qualitativo per monitorare la concorrenza batterica mediata dalla Pseudomonas aeruginosa Sistema di secrezione di tipo VI (T6SS). Il saggio si basa sulla sopravvivenza / uccisione di cellule di Escherichia coli che trasportano un bersaglio LacZ-Reporter. Questa tecnica è regolabile per valutare l'attività battericida / bacteriostasis di T6SS-abili microrganismi.

Video: A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

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Immunologia e infezioni

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Applicazione di lungo termine colta interferone-γ Enzyme Linked immunospot Assay per la valutazione effettori e memoria delle cellule T risposte a Bovino

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Valutazione visiva e microscopiche di Streptomyces mutanti inerente allo sviluppo

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...