Vogliamo ringraziare il laboratorio animale dell'ospedale provinciale di Shandong per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC 82101645), dalla Natural Science Foundation of Shandong Province, China (ZR2020QH088) e dal Science and Technology Support Plan for Youth Innovation of Colleges in Shandong Province (2021KJ051).

Il seguente protocollo è conforme a tutte le linee guida etiche istituzionali relative all'uso di animali da ricerca ed è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali dell'Ospedale Provinciale di Shandong, in Cina. Tutte le manipolazioni chirurgiche sono state eseguite in anestesia profonda e gli animali non hanno avvertito dolore in nessuna fase della procedura.
1. Preparazione pre-operatoria
<ol><li>Sterilizzazione degli strumenti<ol><li>Sterilizzare a vapore gli strumenti chirurgici in autoclave (121°C per 15 minuti) prima dell'intervento. Preparare una quantità sufficiente di suture e aghi monouso.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurazione della piattaforma chirurgica<ol><li>Eseguire l'intervento in una sala dedicata alle procedure chirurgiche. Assegnare un'area del banco di almeno 60 cm x 60 cm per l'operazione. Pulire la superficie dell'area con alcol al 75% e coprirla con un asciugamano medico monouso, quindi disinfettarla con radiazioni ultraviolette con 30 minuti di anticipo (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione degli animali<ol><li>Alloggiare tutti gli animali in una stanza a temperatura controllata (20-25 °C) con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Acclimatare topi femmina C57BL/6 di 8 settimane alla struttura di stabulazione per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Pesare i topi prima dell'intervento. Somministrare a tutti i topi femmine di 9 settimane in anestesia generale mediante iniezione intraperitoneale di tricromoetanolo (280 mg/kg), per ottenere l'indolore in qualsiasi fase della procedura. Iniettare meloxicam (2 mg/kg) per via sottocutanea, circa 1 ora prima dell'operazione per alleviare il dolore.</li>
		<li>Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza corneale durante l'intervento chirurgico.</li>
		<li>Applicare la lozione depilatoria sulla schiena utilizzando un batuffolo di cotone pulito. Lascia agire la lozione su un topo per 3-5 minuti, quindi rimuovi i peli usando garza e cotton fioc. Ripeti questo passaggio fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dal retro del mouse.</li>
		<li>Usa garze e cotton fioc per pulire la pelle con alcol al 75%. Fissare il mouse sulla piattaforma chirurgica utilizzando una striscia di gomma o una corda di cotone (Figura 1B) e applicare una soluzione di iodoforo per pulire la schiena. NOTA: Confermare la profondità dell'anestesia pizzicando un dito del piede prima dell'ovariectomia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ovariectomia
NOTA: Il tricromoetanolo può essere mantenuto per circa 30 minuti, assicurando che l'intervento chirurgico sia completato il più possibile.
<ol><li>Praticare un'incisione dorsale di ~1,0 cm longitudinalmente dalla base della coscia verso l'alto utilizzando un bisturi monouso, assicurandosi che solo la pelle e la fascia sottocutanea siano incise ed evitando di tagliare il peritoneo posteriore in questo momento.</li>
	<li>Tira l'incisione verso sinistra e si può vedere un cuscinetto di grasso bianco. Tagliare ~0,5 cm lungo il cuscinetto di grasso bianco per esporre la cavità intraperitoneale utilizzando micro-pinze e forbici.</li>
	<li>Dopo aver tagliato il peritoneo posteriore, rimuovere lentamente e delicatamente il cuscinetto adiposo bianco dalla cavità intraperitoneale con una micro-pinza. Inumidire immediatamente il tessuto adiposo bianco con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% al di fuori della garza imbevuta. Mantenere il tessuto esposto sempre inumidito mentre si trova all'esterno della cavità addominale.</li>
	<li>Una sostanza granulare rosa, ovvero l'ovaio, è attaccata alla parte inferiore del cuscinetto adiposo bianco (Figura 2A). Le ovaie sono collegate a un dotto sottile, ovvero l'utero. Utilizzare punti di sutura riassorbibili 5-0 per legare l'estremità ovarica dell'utero e rimuovere l'ovaio sinistro (Figura 2B).</li>
	<li>Quando si rimuove un'ovaia, preservare il più possibile il tessuto adiposo circostante. Evitare il contatto diretto tra gli strumenti chirurgici e le ovaie e prevenire l'impianto intraperitoneale del tessuto ovarico.</li>
	<li>Riposizionare con cautela il cuscinetto di grasso bianco nella cavità intraperitoneale. Eseguire una semplice sutura intermittente sul peritoneo posteriore con una sutura assorbibile 5-0 (Figura 2C). Al termine della sutura, pulire l'eventuale sanguinamento con una garza sterile imbevuta di soluzione salina allo 0,9%.</li>
	<li>Tira l'incisione cutanea verso destra e rimuovi l'ovaio destro usando lo stesso metodo.</li>
	<li>Eseguire una sutura intermittente con suture 4-0 non assorbibili e pulire eventuali perdite di sangue con una garza sterile imbevuta di soluzione salina allo 0,9% (Figura 2D).</li>
	<li>Pulire la ferita con una soluzione iodofora dopo aver completato entrambe le suture. Iniettare antibiotici ad ampio spettro per via intraperitoneale.</li>
</ol>3. Osservazione post-operatoria
<ol><li>Spostare i topi in una coperta a temperatura costante di 37 °C dopo l'intervento. Fino a quando i topi non saranno in grado di muoversi liberamente, tieni gli animali nella loro gabbia individuale. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza a sufficienza per mantenere la decubito sternale.</li>
	<li>Iniettare meloxicam (2 mg/kg) per via sottocutanea 24 ore dopo l'operazione per alleviare il dolore.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente i topi per assicurarsi che la ferita chirurgica guarisca correttamente senza che siano presenti segni di complicanze (deiscenza).</li>
</ol>4. Integrazione di estradiolo
<ol><li>Preparare il mangime integrato con estradiolo valerato. Utilizzare 2,6 mg di beta-estradiolo 17-valerato integrato per 1 kg di mangime.</li>
	<li>A 3 giorni dal completamento dell'intervento chirurgico, nutrire i topi con estradiolo valerato.</li>
</ol>5. Iniezione di FSH
<ol><li>Preparare una soluzione di FSH umano ricombinante. Sciogliere la polvere di FSH umano ricombinante per iniezione con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% a 100 UI/mL.</li>
	<li>Raggruppare i topi secondo i piani sperimentali e somministrare solvente o diverse dosi di FSH ricombinante tramite iniezione intraperitoneale per 2 settimane. In base all'attività biologica dell'FSH ricombinante, utilizzare la dose iniettabile di FSH nei topi equivalente al livello sierico di FSH nelle donne durante il periodo di transizione della menopausa. NOTA: Sulla base di diversi trattamenti, i topi ovariectomizzati con estrogeni sono stati divisi in modo casuale in tre gruppi, gruppo solvente (NS) che ha ricevuto 100 μL/die solvente, gruppo FSH A BASSO DOSAGGIO (L-FSH) che ha ricevuto 15 UI/kg di peso corporeo al giorno e gruppo FSH ad alte dosi (H-FSH) che ha ricevuto 30 UI/kg di peso corporeo al giorno.</li>
</ol>

Sviluppo di un modello murino ovariectomizzato con livelli elevati di FSH

<ol>
	<li>Harlow, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+summary+of+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+++10:+addressing+the+unfinished+agenda+of+staging+reproductive+aging.">Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging.</a> Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).</li><li>Ulloa-Aguirre, A., Zari&#241;&#225;n, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Follitropin+Receptor:+Matching+Structure+and+Function.">The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function.</a> Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).</li><li>Franks, S., Stark, J., Hardy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+anovulation+in+polycystic+ovary+syndrome.">Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome.</a> Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+FSH+inhibits+hepatic+cholesterol+biosynthesis+and+reduces+serum+cholesterol.">Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol.</a> Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).</li><li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+blockade+improves+cognition+in+mice+with+Alzheimer's+disease.">FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease.</a> Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+Directly+Regulates+Bone+Mass.">FSH Directly Regulates Bone Mass.</a> Cell. 125 (2), 247-260 (2006).</li><li>Liu, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+fat+accumulation+and+redistribution+in+aging+through+the+G&#945;i/Ca(2+)/CREB+pathway.">FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the G&#945;i/Ca(2+)/CREB pathway.</a> Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).</li><li>Maclellan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Vascular+Anomalies.">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+FSH+induces+thermogenic+adipose+tissue+and+reduces+body+fat.">Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat.</a> Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).</li><li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+monoclonal+antibodies+to+FSH&#946;+increase+bone+mass.">Epitope-specific monoclonal antibodies to FSH&#946; increase bone mass.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).</li><li>El Khoudary, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trajectories+of+estradiol+and+follicle-stimulating+hormone+over+the+menopause+transition+and+early+markers+of+atherosclerosis+after+menopause.">Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause.</a> European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).</li><li>Radu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Follicle-Stimulating+Hormone+Receptor+in+Tumor+Blood+Vessels.">Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).</li><li>Sowers, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+hormones+and+bone+turnover+markers+in+pre-+and+perimenopausal+women:+SWAN.">Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN.</a> Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).</li><li>Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., B&#248;rresen-Dale, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+susceptibility+and+environmental+estrogen-like+compounds.">Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante il passaggio da una fase riproduttiva a una non riproduttiva (menopausa), molte donne sperimentano significativi cambiamenti fisiologici e patologici. I livelli di FSH aumentano durante la transizione menopausale1. Studi emergenti hanno rivelato che l'FSH in vari tessuti e organi extragonadici è fondamentale nella patogenesi di molteplici malattie, tra cui la dislipidemia4, il morbo di Alzheimer5, l'osteoporosi 9,10, l'aterosclerosi11, l'obesità9 e il cancro12. Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante. Il modello murino OVF imita la fase iniziale della transizione alla menopausa con estrogeni relativamente stabili e livelli di FSH in aumento ed è particolarmente adatto per studi volti a esplorare le azioni extragonadiche di FSH.
In questo metodo, l'ovariectomia è stata eseguita utilizzando una singola incisione dorsale posteriore, a circa 1 cm dalla base della coscia verso l'alto (Figura 1B). La pelle è stata tagliata quasi insieme ai muscoli dorsali utilizzando forbici da dissezione affilate, e si è così acceduto alla cavità peritoneale. Dopo l'operazione, l'incisione muscolare non ha richiesto sutura e la ferita cutanea è stata chiusa bilateralmente con una sutura catgut (Figura 2). L'operazione è tecnicamente più semplice, meno dispendiosa in termini di tempo e meno dannosa per i topi femmina rispetto ad altri metodi utilizzati.
Alcuni dettagli che dovrebbero essere curati durante la procedura chirurgica. In primo luogo, tutte le procedure chirurgiche devono essere mantenute pulite e il più sterili possibile per ridurre il rischio di infezione postoperatoria. In secondo luogo, poiché il tessuto ovarico è molto fragile, gli strumenti chirurgici non possono entrare in contatto diretto con le ovaie durante l'ovariectomia, per evitare l'impianto intraperitoneale. In terzo luogo, dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati spostati in una coperta a temperatura costante di 37 °C durante il recupero per prevenire l'ipotermia postoperatoria che portava alla morte.
Uno studio precedente ha dimostrato che gli estrogeni endogeni sono sintetizzati nelle cellule teche ovariche delle donne in premenopausa o nelle cellule stromali adipose del seno delle donne in postmenopausa e in quantità minori nel tessuto periferico14. Gli estrogeni sierici sono diminuiti bruscamente per i topi ovariectomizzati, ma non possono essere eliminati (Figura 3B). Tuttavia, gli estrogeni endogeni sintetizzati nel tessuto extragonadico non influenzano la stabilità dei livelli di estrogeni nel modello OVF (Figura 4B).
Il modello OVF presenta alcune limitazioni. Una volta che l'operazione chirurgica non è attenta e porta all'impianto intraperitoneale ovarico, può portare al fallimento del modello. In questo caso, l'estrogeno sierico non diminuisce bruscamente e fluttua durante le diverse fasi del ciclo estrale. Dopo la somministrazione esogena di estrogeni e FSH, ci vuole circa 1 settimana perché il corpo raggiunga l'equilibrio. Pertanto, i cambiamenti patologici del modello OVF che si verificano entro 1 settimana non possono indicare gli effetti dell'FSH.
In conclusione, il modello OVF ha il vantaggio di essere stabile, a basso costo e facile da usare. Gli effetti sistemici di FSH ad alti livelli possono essere osservati dopo l'iniezione intraperitoneale di FSH; cioè, il modello OVF è adatto per studi che esplorano le azioni extragonadiche di FSH. Tuttavia, i requisiti per la chirurgia del modello e le procedure di iniezione intraperitoneale sono piuttosto elevati. Se il finanziamento è sufficiente, i modelli specifici di knockout sono la scelta migliore.

I livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH) aumentano durante la transizione menopausale (il termine transizione menopausale è stato definito nel 2011 in fase di invecchiamento riproduttivo workshop (STRAW) + 10 system)1. È durante la transizione della menopausa, un periodo caratterizzato da un aumento dei livelli di FSH e da una posizione relativamente stabile di estrogeni1, che le donne sperimentano cambiamenti del ciclo mestruale e cambiamenti fisiologici significativi che coinvolgono varie cellule e tessuti. Questi cambiamenti possono influire seriamente sulla qualità della vita e sulla salute delle donne. Esplorare gli effetti dell'FSH può migliorare la qualità della vita e la salute delle donne.
L'FSH è secreto dalle cellule gonadotrope dell'ipofisi anteriore ed è fondamentale per controllare la funzione gonadica e la riproduzione2. La funzione dell'FSH è mediata dal recettore dell'FSH (FSHR), che appartiene al recettore accoppiato alla proteina G (GPCR)3. La FSHR è generalmente espressa nelle gonadi, vale a dire l'ovaio e il testicolo. È stato dimostrato che la FSHR è universalmente espressa in più cellule e tessuti extragonadici, tra cui fegato4, ippocampo5, osteoclasti6, adipociti7 e cellule endoteliali8. Studi emergenti hanno rivelato azioni gonadiche extra di FSH e la sua potenziale rilevanza clinica nella dislipidemia4, nel morbo di Alzheimer5, nell'osteoporosi 9,10, nell'aterosclerosi11, nell'obesità9 e nel cancro12. Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante per esplorare le azioni del solo FSH.
Nel protocollo, abbiamo introdotto la procedura per stabilire un modello murino con estrogeni relativamente stabili e livelli crescenti di FSH13. Il modello murino imita la transizione della menopausa mediante chirurgia ovariectomizzata e quindi integrato con estradiolo valerato e FSH ricombinante. Poiché i topi ovariectomizzati sono stati integrati con estrogeni esogeni per mantenere livelli di estrogeni simili con i topi operati fittizi, i livelli di FSH endogeno erano stabili a causa del feedback degli estrogeni alla ghiandola pituitaria. In questa condizione, potrebbe controllare i livelli di FSH somministrando FSH esogeno senza alterare i livelli di estrogeni. Pertanto, il modello murino OVF può escludere l'influenza degli estrogeni e osservare gli effetti fisiologici e patologici extragonadici di FSH. Riteniamo che la procedura dettagliata e visualizzata sia utile ai ricercatori per stabilire il modello murino OVF nel loro laboratorio e applicarlo per studiare i cambiamenti fisiologici e patologici durante la transizione della menopausa, se necessario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>beta-estradiol 17-valerate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>E829824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estradiol sensitive ELISA</td>
			<td>Demeditec</td>
			<td>DE4399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Staining Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>M129228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human Follicle-stimulating hormone</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>N19Z8803G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring independent effects of follicle-stimulating hormone in vivo in a mouse model

Durante il passaggio da una fase riproduttiva a una non riproduttiva (menopausa), molte donne sperimentano significativi cambiamenti fisiologici e patologici, tra cui la diminuzione della massa ossea, l'aumento dei lipidi nel sangue e l'aumento dell'adiposità viscerale. I livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH) aumentano durante la transizione della menopausa. Molti studi hanno dimostrato che l'FSH in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Pertanto, la costruzione di un modello animale che possa aiutare a studiare gli effetti indipendenti dell'FSH in vivo è particolarmente importante. In questo studio, topi femmina C57BL/6 sono stati ovariectomizzati e completati con estradiolo valerato (OVX + E2) per eliminare l'effetto dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. I topi OVX + E2 hanno ricevuto solvente (N.S.) o diverse dosi di FSH ricombinante tramite iniezione intraperitoneale per creare un modello murino (OVF) caratterizzato da estrogeni relativamente stabili e livelli crescenti di FSH. Pertanto, abbiamo generato con successo un modello murino sperimentale per imitare la fase iniziale della transizione della menopausa, caratterizzata da elevati livelli sierici di FSH. Il modello OVF presenta i vantaggi di essere stabile, a basso costo e facile da usare, il che è adatto per studi volti a esplorare le azioni extragonadiche dell'FSH. Qui descriviamo i protocolli dettagliati per il modello OVF del topo.

Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition (the term menopausal transition was defined in 2011 at stages of reproductive aging workshop (STRAW) + 10 system)1. It is during the menopausal transition, a period characterized by rising FSH levels and relatively stable estrogen1, thatwomen experience menstrual cycle changes and significant physiological changes involving various cells and tissues. These changes can seriously affect the quality of life and health of women. Exploring the effects of FSH may improve women's quality of life and health.
FSH is secreted from gonadotrope cells in the anterior pituitary and is critical in controlling gonadal function and reproduction2. The function of FSH is mediated through the FSH receptor (FSHR), which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)3. FSHR is generally expressed in gonads, namely, the ovary and testis. It has been proved that FSHR is universally expressed in multiple extragonadal cells and tissues, including liver4, hippocampus5, osteoclasts6, adipocytes7, and endothelial cells8. Emerging studies have revealed extra gonadal actions of FSH and its potential clinical relevance in dyslipidemia4, Alzheimer's disease5, osteoporosis9,10, atherosclerosis11, obesity9, and cancer12. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important in exploring the actions of FSH alone.
In the protocol, we introduced the procedure for establishing a mouse model with relatively stable estrogen and rising FSH levels13. The mouse model mimics the menopause transition by ovariectomized surgery and then supplemented with estradiol valerate and recombinant FSH. As the ovariectomized mice were supplemented with exogenous estrogen to maintain similar estrogen levels with the sham-operated mice, the levels of endogenous FSH were stable due to estrogen feedback at the pituitary gland. In this condition, it could control the FSH levels by administering exogenous FSH without altering the estrogen levels. Thus, the OVF mouse model can exclude the influence of estrogen and observe the extragonadal physiological and pathological effects of FSH. We believe the detailed and visualized procedure is useful for researchers to establish the OVF mouse model in their laboratory and apply it to investigate physiological and pathological changes during the menopause transition as needed.

Autore in primo piano: Indagine sulla relazione tra FSH e cambiamenti fisiopatologici nelle donne in perimenopausa - Approfondimenti da un modello murino 

Esplorazione degli effetti indipendenti dell'ormone follicolo-stimolante in vivo in un modello murino

Our research is focused on physiological and pathological changes in perimenopausal women. In this study, we are trying to determine which pathophysiological alternations are related to FHC. Menopause is associated with dyslipidemia and an increased risk of cardio-cerebrovascular disease.Using this mouse model, we found that follicle-stimulating hormone, independent of aspirin, increases serum cholesterol levels. Moreover, blocking FSH signaling could effectively prevent hypocholesterolemia. This mouse model mimics the early stage of the menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels and relatively stable estrogen levels.The model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extra gonadal actions of FSH.

Il modello murino OVF imita la fase iniziale della transizione della menopausa con estrogeni relativamente stabili e livelli di FSHin aumento 13. In primo luogo, per l'intervento chirurgico di rimozione ovarica, ai topi femmina C57BL/6 di 9 settimane è stata somministrata l'anestesia generale e sottoposti a un'operazione fittizia (Sham) o a un'ovariectomia bilaterale (OVX). Poiché le immagini striscio delle cellule colorate con Papanicolaou hanno identificato chiaramente le fasi del proestro, dell'estro, del metestrus e del diestro del ciclo estrale, i topi OVX hanno perso il ciclo estrale (Figura 3A) e il metodo ELISA ha mostrato una significativa diminuzione dei livelli sierici di estradiolo (E2) (Figura 3B). In secondo luogo, i topi OVX sono stati integrati con beta-estradiolo 17-valerato (OVX + E2) per mantenere gli estrogeni sierici allo stesso livello del gruppo Sham. In terzo luogo, i topi OVX + E2 hanno ricevuto solvente (NS) o diverse dosi di FSH ricombinante tramite iniezione intraperitoneale per creare un modello murino (OVF) caratterizzato da estrogeni relativamente stabili e livelli di FSH in aumento (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig01.jpg"> Figura 1. Ambiente chirurgico e postura del topo. (A) Una superficie del banco di almeno 60 cm x 60 cm per l'operazione. Pulire la superficie dell'area con alcol al 75% e coprirla con un asciugamano medico monouso, quindi disinfettare con radiazioni ultraviolette con 30 minuti di anticipo. (B) Fissare il mouse sulla piattaforma chirurgica utilizzando una striscia di gomma o una corda di cotone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig02.jpg"> Figura 2. Fasi chiave dell'operazione chirurgica. (A) posizione ovarica, (B) ovariectomia, (C) peritoneo di sutura e (D) incisione cutanea della sutura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig03.jpg"> Figura 3. Citologia vaginale. La citologia vaginale rappresenta gli stadi del ciclo estrale e degli estrogeni endogeni nei topi ovariectomizzati (OVX) e in quelli operati fittiziamente (Sham; n = 12 per il gruppo Sham; n = 10 per i gruppi OVX). (A) La citologia vaginale rappresenta le fasi del ciclo estrale in base alla presenza relativa di leucociti, cellule epiteliali cornificate e cellule epiteliali nucleate. Gli stadi dell'estro includono il proestro, la predominanza di cellule epiteliali nucleate; estro, la predominanza di cellule cornificate enucleate; metastro, la presenza di leucociti e cellule epiteliali cornificate e nucleate; Diestro, la predominanza dei leucociti. Barra della scala = 100 μm. (B) Estrogeni endogeni nei topi ovariectomizzati (OVX) e in quelli operati fittiziamente (Sham). I dati sono mostrati come media ± SEM. Il test t di Student viene utilizzato per l'analisi statistica. p< 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65665/65665fig04.jpg"> Figura 4. Modello OVF e livelli sierici di ormoni. (A) Diagramma di flusso modello OVF. (B) Analisi ELISA delle concentrazioni sieriche di estrogeni (E2) e FSH. I dati sono rappresentati come media ± SEM. Per l'analisi statistica è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale. * p< 0,05 e ** p< 0,01. Questa cifra è stata modificata da4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65665/65665fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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L'ormone follicolo-stimolante (FSH) in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Il modello murino ovariectomizzato e trattato con FSH (OVF) può essere utilizzato per esplorare le azioni extragonadiche di FSH.

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological ...

La nostra ricerca è focalizzata sui cambiamenti fisiologici e patologici nelle donne in perimenopausa. In questo studio, stiamo cercando di determinare quali alternanze fisiopatologiche sono correlate alla FHC. La menopausa è associata a dislipidemia e ad un aumentato rischio di malattie cardio-cerebrovascolari.Utilizzando questo modello murino, abbiamo scoperto che l'ormone follicolo-stimolante, indipendente dall'aspirina, aumenta i livelli sierici di colesterolo. Inoltre, il blocco della segnalazione dell'FSH potrebbe prevenire efficacemente l'ipocolesterolemia. Questo modello murino imita la fase iniziale della transizione alla menopausa, caratterizzata da elevati livelli sierici di FSH e livelli di estrogeni relativamente stabili.Il modello presenta i vantaggi di essere stabile, a basso costo e facile da usare, il che è adatto per gli studi per esplorare le azioni gonadiche extra dell'FSH.

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Research

JoVE Journal

Biology

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

1.1K Views.  The Affiliated Hospital of Qingdao University. La nostra ricerca è focalizzata sui cambiamenti fisiologici e patologici nelle donne in perimenopausa. In questo studio, stiamo cercando di determinare quali alternanze fisiopatologiche sono correlate alla FHC. La menopausa è associata a dislipidemia e ad un aumentato rischio di malattie cardio-cerebrovascolari.Utilizzando questo modello murino, abbiamo scoperto che l'ormone follicolo-stimolante, indipendente dall'aspirina, aumenta i livelli sierici di colesterolo. Inoltre, il blocco...

Video: Autore in primo piano: Indagine sulla relazione tra FSH e cambiamenti fisiopatologici nelle donne in perimenopausa - Approfondimenti da un modello murino 

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.

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Creating an Ovariectomized and Follicle Stimulating Hormone (FSH)-Treated Mouse Model for Exploring the Extragonadal Actions of FSH

To begin, prepare the surgery platform setup in a room with a bench area of 60 centimeters by 60 centimeters for the operation. Clean the surface with 70%alcohol and cover it with a disposable medical towel. Then, disinfect the area with ultraviolet radiation for 30 minutes.Acclimate eight-week-old female C57 black/6 mouse to the housing facility for one week before surgery. Using a clean cotton swab, apply hair removal lotion to the back of the anesthetized mouse. After three to five minutes, remove the hairs using gauze and cotton swabs.Next, clean the skin with 70%ethanol. Fix the mouse on the surgery platform with its back facing up using a rubber strip or cotton rope, and apply iodophor solution to clean the back. For ovariectomy, using a disposable scalpel, make a one-centimeter dorsal incision longitudinally from the thigh base upwards, ensuring that only the skin and subcutaneous fascia are incised and avoiding cutting into the posterior peritoneum.Next, pull the incision to the left to visualize a white fat pad. Using microforceps and scissors, cut 0.5 centimeters along the white fat pad to expose the intraperitoneal cavity. After cutting the posterior peritoneum, using microforceps, slowly and gently remove the white fat pad from the intraperitoneal cavity.Immediately following removal, moisten the white fat tissue with 0.9%sterile saline-soaked gauze. In the lower part of the white fat pad, identify the pink granular substances as ovaries and ensure they are connected to the uterus. Using 5O absorbable sutures, ligate the ovarian end of the uterus.Then, remove the left ovary, avoiding direct contact between surgical instruments and the ovaries, preventing intraperitoneal implantation of ovarian tissue. After surgery, carefully place the white fat pad back into the intraperitoneal cavity. Then, using a 5-0 absorbable suture, perform an intermittent suture on the posterior peritoneum.Clean any areas of bleeding with gauze soaked in 0.9%sterile saline. Next, pull the skin incision to the right and remove the right ovary using the same method. Perform an intermittent suturing with 4-0 non-absorbable sutures and clean any bleeding with 0.9%sterile saline-soaked gauze.After completing both sutures, clean the wound with an iodophor solution. After 24 hours, inject meloxicam subcutaneously to relieve pain. Monitor the mouse daily to confirm proper surgical wound healing without any signs of complications.After three days, feed the mouse with freshly prepared estradiol valerate. For FSH injection, prepare FSH solution by dissolving recombinant human FSH powder in 0.9%sterile saline to 100 international units per milliliter. According to the biological activity of recombinant FSH, administer solvent or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection for two weeks.The smear images of Papanicolaou-stained cells clearly identified the proestrus, estrus, metestrus, and diestrus stages of the estrus cycle. In contrast, the bilateral ovariectomy mice lost the estrus cycle. The ELIZA method showed a significant decrease in serum estradiol levels in bilateral ovariectomy mice compared to the sham group mice.The endogenous estrogen synthesized in the extra gonadal tissue does not affect the stability of estrogen levels in the FSH-treated mouse model.