Vorremmo ringraziare Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: linea GFP), l&#39;Bloomington Stock Center, e il Developmental Studies Ibridoma Banca dei reagenti. Abbiamo inoltre Ringraziamo tutti i membri del Tootle Lab per utili discussioni e critiche del manoscritto. Finanziamento dal National Science Foundation MCB-1158527, e fondi di start-up del Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Università di Iowa sostenuto questo lavoro. National Institutes of Health Predoctoral formazione di Grant in Scienze Farmacologiche T32GM067795 supportato AJS. Supporto di memorizzazione dei dati sono state fornite dal ICTS, che è finanziato attraverso il CTSA sostenuto dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e il Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze traslazionale, National Institutes of Health, attraverso di Grant UL1RR024979.

1. Preparazione Drosophila Prima di stage isolamento <ol><li> Rendere lievito in pasta umida combinando 50 g di lievito secco con 90 ml di acqua distillata. Mescolare con una spatola per unire. Lasciare riposare l&#39;impasto per ~ 30 minuti prima di valutare la coerenza. La consistenza dovrebbe essere abbastanza spesso per aderire al lato di un flaconcino mosca ma non correre lungo il lato. Per ottenere la consistenza desiderata può essere necessario aggiungere fino a 10 ml di acqua aggiuntiva o una piccola quantità di lievito secco. Conservare in un contenitore coperto a 4 ° C. Il lievito memorizzate possono essere utilizzate per ~ 1-2 settimane. </li><li> Raccogliere &lt;24 hr vecchie mosche adulti (maschi e femmine) dei genotipi desiderate e metterli in un flaconcino con la mosca oltre al cibo umido lievito in pasta spalmato sul lato del flaconcino. La temperatura alla quale linea sono mantenuti varierà secondo l&#39;esperimento. Per gli esperimenti di routine, mosche sono mantenute a temperatura ambiente. Considerando esperimenti in cui un gene èessendo iperespresso utilizzando il sistema UAS/GAL4 15 maggio richiedere mantenendo linea a 25 ° C o più, a seconda dei casi. </li><li> Fornire linea con striscio di lievito in pasta giornaliero per 2 giorni. NOTA: Dato che lo sviluppo del follicolo è strettamente regolata dallo stato nutrizionale della mosca femminile, è essenziale per fornire al volo con la sostanza nutritiva ricca lievito in pasta per almeno 36 ore prima della dissezione. </li></ol> 2. Isolamento di Mid-fine Staged Drosophila follicoli <ol><li> Lasciare i media a temperatura ambiente (~ 30 min). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per test di sviluppo in vitro, fresco preparare IVEM supporto (supporti di Grace insetti, calore inattivato siero fetale bovino al 10%, e 1x penicillina / streptomicina). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per mRNA o isolamento delle proteine ​​utilizzano o insetti di Grace o IVEM media. IMPORTANTE: la temperatura media è fondamentale. Se il supporto è freddo si alterasia il citoscheletro actina e microtubuli e sviluppo blocco. </li><li> Anestetizzare le mosche in flaconcino yeasted iniettando gas CO 2 e collocare 3-5 mosche di sesso femminile su un pad mosca sotto CO 2. IMPORTANTE: Non lasciare più femmine che può essere sezionato in un periodo di tempo di 10 min sul ​​pad volo come l&#39;esposizione estesa a CO 2 può causare la sterilità e morte. </li><li> Riempire un pozzetto di una piastra 9 posto con i media e posizionarlo sulla cima di una superficie scura (un pezzo di plexiglass nero funziona bene). Focalizzare l&#39;ambito dissezione sul fondo del pozzo. </li><li> Uso # 5 pinze Dumont raccogliere una donna sola con una sola mano (questo è meglio farlo con la mano dominante). Spesso è più facile prendere il femminile dalle ali, gambe e torace per la transizione addome. Immergere la femmina nei media riempite bene. Regolare la messa a fuoco del microscopio, se necessario. </li><li> Utilizzo di una seconda coppia di pinze tenuto in mano non dominante, afferrare la femmina alla fine anteriore dell&#39;addomein modo che l&#39;estremità posteriore è posizionata verso la mano dominante (Figura 2A). Assicurarsi di mantenere la mosca sommersa nei media. </li><li> Con la mano dominante, utilizzare la pinza per afferrare la cuticola al segmento pigmentata più posteriore secondo e strappare via dal resto dell&#39;addome (Figure 2B-C). </li><li> Utilizzando la pinza in mano dominante, premere delicatamente l&#39;estremità anteriore dell&#39;addome fino a quando le ovaie emergono (figure 2D-E). Se necessario, posizionare la pinza tra le due ovaie e tirarli fuori dalla carcassa. </li><li> O spostare le ovaie a un nuovo pozzo con mezzi freschi (Figura 2F) o rimuovere la carcassa di un tovagliolo Kimwipe o carta. Questo è particolarmente importante se follicoli sono stati isolati per lo sviluppo in vitro. </li><li> Ripetere l&#39;operazione finché non sono stati isolati 3-5 paia di ovaie. NOTA: Ogni ovaio è composta da ~ 16 ovarioli o catene di sequenza maturazione follicoli. Ogni ovarioleè contenuta all&#39;interno di una guaina muscolare. </li><li> Utilizzando morse pin e gli aghi in dotazione con loro, tirare delicatamente a parte l&#39;ovaio eseguendo gli aghi tra i ovarioli (Figura 2G). Ciò a volte sbloccare i singoli follicoli pure. </li><li> Ovarioli individuali e le fasi morfologiche facilmente distinguibili di sviluppo del follicolo dovrebbero essere visibili (Figura 2G, preso in giro a parte dell&#39;ovaio). Fare riferimento alle figure 1 e 2H per differenze morfologiche che possono essere utilizzati per distinguere le diverse fasi. Per isolare follicoli che sono all&#39;interno ovarioli intatti e ancora contenuti in una guaina muscolare, utilizzare un ago per tagliare tutti i ovariole al anteriore del follicolo precedente e al posteriore del follicolo immediatamente successivo follicolo di interesse. Questo romperà la guaina muscolare e follicolo di interesse distanza può essere tagliato via dai follicoli limitrofi senza danneggiarlo. </li&gt; <li> Come singoli stadi sono separati, spostare i follicoli di interesse, utilizzando una pipetta di vetro, di un nuovo pozzo con mezzi freschi. Ciò è particolarmente importante quando isolando follicoli per lo sviluppo in vitro. NOTA: È importante schiacciare il bulbo della pipetta prima di entrare media per evitare le bolle d&#39;aria dalla ridistribuzione dei follicoli di interesse in tutto il pozzetto. Inoltre, se i follicoli stanno attaccando la pipetta di vetro, la pipetta può essere una fase solida con 3% albumina di siero bovino (BSA) pipettando la soluzione BSA su e giù diverse volte e risciacquare con i media dissezione. </li><li> Una volta abbastanza follicoli sono stati isolati, procedere con esperimenti successivi. </li></ol> 3. In vitro per lo sviluppo di follicoli S10B <ol><li> Isolare follicoli S10B utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM. Assicurarsi che i follicoli sono rapidamente allontanati dai detriti. Poiché questi follicoli continueranno a maturare, è imponella documentazione, che S10Bs sono raccolti per 30-60 min e poi inserito nel supporto maturazione di scelta. NOTA: S10B devono essere accuratamente distinto dai follicoli S10A (Figura 1C rispetto al 1B), in quanto i follicoli S10A non matureranno nella cultura dei media IVEM. In entrambi S10A e S10B follicoli, metà della lunghezza è composto da cellule infermiere e l&#39;altra metà è l&#39;ovocita, ma in S10B la lunghezza del follicolo è uguale a quella dei follicoli S14. </li><li> Usando una pipetta di vetro, spostare ~ 30 follicoli S10B in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. NOTA: Assicurarsi di verificare che tutti i follicoli in fase di trasferimento sono S10B e non hanno maturato alla S11. </li><li> Preparare 1 ml di media stagionatura per bene, cioè supporti IVEM più reattivi farmacologici. </li><li> Usando una pipetta di vetro tirato *, rimuovere il più supporti dal pozzo (passo 3.2) come possibile, e rapidamente aggiungi maturazione di supporto desiderato. NOTA: è indispensabile utilizzare un pip di vetro tiratoette come follicoli in scena può essere facilmente assimilato sia con pipette in vetro o punte di pipette con Pipetman. * Per fare pipette tirato: 1) riscaldare la parte sottile di lunghi, pipette di vetro nella fiamma di un becco Bunsen solo fino a quando il vetro comincia ad ammorbidirsi, 2) spostare immediatamente la pipetta dalla fiamma e tirare orizzontalmente per disegnare la pipetta in un tubo sottile, 3) rompere per generare un punto di fine. ATTENZIONE: Usare protezioni per gli occhi come frammenti di vetro possono volare via. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,4 per il numero di pozzi come l&#39;esperimento richiede. </li><li> Consentire follicoli di sviluppare per&gt; 10 ore e segnare la progressione evolutiva in un ambito di dissezione. NOTA: Gli esperimenti sono in genere segnati il ​​giorno successivo per consentire un tempo sufficiente per i follicoli a sviluppare. S10B è ~ 5 ore, S11 è ~ 30 minuti, S12 è ~ 2 ore, e la S13 è ~ 1 ora di durata a 25 ° C 1 e sviluppo a temperatura ambiente prenderà leggermente più lungo. Esperimenti simili a quello descritto per i follicoli S10B possono essereeseguita utilizzando follicoli S11-S13. </li></ol> 4. Isolamento palco per Live Imaging <ol><li> Isolare follicoli fase tardiva (S10B-14) che esprime il marcatore fluorescente di scelta utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM, muovendosi rapidamente i follicoli lontano dai detriti. </li><li> Spostare follicoli di interesse in nuovi media e poi il trasferimento da pipetta di vetro per una Petri piastra inferiore vetrino. Abbiate cura di aggiungere supporti in modo che bolle nella zona inferiore vetrino, ma non trabocchi. </li><li> Per lunghi film intervallati, a volte è necessario mantenere l&#39;umidità all&#39;interno della piastra Petri aggiungendo un arrotolata Kimwipe inumidito con acqua, al bordo interno della piastra Petri. Mettere il coperchio sulla parte superiore. </li><li> Immagine su un microscopio invertito. Risoluzione dettagliata richiederà microscopia confocale. È necessario bilanciare frequenza di immagini, la forza di illuminazione, e la lunghezza di immagini; questo dovrà essere lavorato in modo indipendente per ogni lstrumento Abeling e processo di sviluppo. </li></ol> 5. Isolamento Palco per mRNA Preparazione <ol><li> Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM. </li><li> Usando una pipetta di vetro, spostare le singole fasi di interesse in nuovi pozzetti con media; è possibile raccogliere più fasi contemporaneamente. </li><li> Mantenere tempi di recupero in 1 ora. Spostare i follicoli, utilizzando una pipetta di vetro, provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare brevemente la provetta in un mini-microcentrifuga per far sedimentare tutti i follicoli. Usando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4), rimuovere con attenzione tutti i mezzi di comunicazione. NOTA: Se si utilizza una microcentrifuga full size, centrifugare i follicoli a bassa velocità. </li><li> Aggiungere 100 ml di Trizol e macinare a mano per ~ 20 secondi usando un pestello in plastica. Spin giù a tutta velocità in una microcentrifuga e passare Trizol in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga facendo attenzione a non disturbare alcun d pellettatoebris. Conservare a -80 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi 5,1-5,5 fino a quando sono stati ottenuti abbastanza follicoli per l&#39;esperimento. Ordinariamente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 e S14 ~ 100 follicoli cedere ~ 10 mg di RNA. </li><li> Scongelare i campioni sul ghiaccio. Combina campioni, a seconda dei casi, in una provetta per microcentrifuga e portare il volume Trizol fino a 800 ml. Procedere con isolamento di RNA come indicato dal costruttore. IMPORTANTE: Ricordarsi di DNasi trattare l&#39;RNA isolato con RNasi libero DNasi. </li></ol> 6. Isolamento Palco per Western Blotting <ol><li> Preriscaldare un blocco di calore a 100 ° C. </li><li> Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM. NOTA: È necessario determinare empiricamente quanti di un particolare follicolo fase sono necessarie per osservare ogni specifica proteina. Per le proteine ​​altamente espresse 1-3 S10B follicoli / e è sufficiente per vedere un segnale forte su una macchia occidentale. Tuttavia, è importante fare unacampione rappresentativo, tenendo follicoli da più femmine. Così, 15-20 follicoli di una fase particolare sono di solito raccolti. </li><li> Spostare follicoli, usando una pipetta di vetro, una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Spin brevemente in un mini-microcentrifuga per far sedimentare i follicoli (vedi punto 5.4). Rimuovere con attenzione tutti i media utilizzando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4) e aggiungere 50 ml di PBS 1x e 50 ml di tampone 2x Laemmli. </li><li> Macinare a mano per ~ 20 sec con un pestello in plastica. NOTA: pestelli di plastica possono essere riutilizzati per la macinazione di campioni occidentali con il lavaggio e la sterilizzazione in autoclave. </li><li> Bollire i campioni per 10 minuti nel blocco termico. </li><li> Raffreddare brevemente su ghiaccio e far girare a piena velocità per 15 secondi in una microcentrifuga. O caricare immediatamente su un gel SDS-PAGE o conservare a -20 ° C. NOTA: Se vengono memorizzati i campioni, ricordatevi di reboil i campioni prima di caricare sul gel. </li><li> Eseguire l&#39;analisi Western Blot seguenti protocolli standard. </li></ol>

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Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il follicolo Drosophila è composto da un piccolo numero di tipi cellulari, rendendolo ideale sia morfologica e analisi molecolari. Inoltre, a causa della struttura dell&#39;ovaio, è relativamente facile ottenere un gran numero di stadi specifici dello sviluppo del follicolo con un ambito dissezione comune e una formazione minima. Come ogni tappa rappresenta una breve finestra temporale, isolamento stadio può offrire notevoli spunti molecolari nei processi di sviluppo che si verificano durante tale fase. Ad e...

Ogni ovaio Drosophila è composto di ~ 16 ovarioli, o catene di sequenza maturazione camere di uova o follicoli. Ogni follicolo è costituito da un unico ovocita, derivate cellule nutrici o di sostegno 15 della linea germinale, e ~ 650 cellule somatiche chiamati cellule follicolari (Figura 1A). Drosophila oogenesi è diviso in 14 tappe morfologicamente definiti di sviluppo 1. Ogni stadio di sviluppo follicolare è osservato più volte all&#39;interno di una singola mosca, rendendo relativamente facile isolare un consistente numero di follicoli stadio-specifica. Medio-tardiva Le tappe di dell&#39;ovogenesi (Tappe 10B-14) sono particolarmente adatti per l&#39;isolamento stadio (Figura 1). Nella Fase 10B (S10B), il follicolo è completamente allungata (cioè la sua lunghezza è pari a quella di uno Stage 14 (S14) follicolo, vedi Figura 1 e Figura 2H) e metà della lunghezza del follicolo è composto da cellule infermierementre l&#39;altra metà è l&#39;ovocita (Figura 1C). In questa fase le cellule nutrici subiscono drammatico rimodellamento actina, il rafforzamento del actina corticale e la generazione di fasci paralleli di filamenti di actina 2. Allo stesso tempo, una popolazione di cellule del follicolo, chiamato cellule centripete, migrare tra le cellule infermiere e l&#39;ovocita, e due gruppi di cellule follicolari dorsali diventa specificato sottoporsi migrazione per formare le appendici dorsali, apparecchi respiratori tubolari per l&#39;embrione 3 . Le cellule nutrici poi contrattuali (S11), spremere il loro contenuto citoplasmatico nell&#39;ovocita in un processo chiamato cella di infermiere dumping, che fornisce l&#39;ovocita con i fattori necessari per poter completare l&#39;embriogenesi (Figura 1D). Le cellule vengono poi sottoposte infermiere morte cellulare (S12-S13) 4, e le cellule follicolari secernono e modello del guscio 5 (Figure 1E-G). Così, alla fine dell&#39;oogenesi è ricca di un importante sviluppod processi morfogenetici. Isolato follicoli medio-fase recente (S10B-S14) possono essere utilizzati per una varietà di scopi, comprese le analisi molecolari. Ad esempio, mRNA da follicoli in scena può essere isolato per RT-PCR, microarray, o analisi RNA-seq. Questo permette di guardare l&#39;espressione genica in un breve lasso di sviluppo, con solo pochi tipi di cellule presenti, e determinare come l&#39;espressione genica è cambiato da perturbazioni sia farmacologici o genetici. Isolamento fase può anche essere usato per guardare proteine ​​mediante western blotting. Tale analisi è importante perché permette di quantificare il livello di espressione della proteina in wild-type contro mutanti nelle fasi specifiche. Sebbene si possa usare immunofluorescenza analisi per ottenere risultati simili, quantificazione della fluorescenza è meno robusta a causa dei requisiti rigorosi che tutti i pixel essere compresa nell&#39;intervallo lineare di rilevamento 6. Inoltre, l&#39;analisi western blot può fornire altre informazioni, ad uns se la proteina viene posttranslationally modificato o è espressa da una specifica isoforma di splicing. Isolato fasi possono anche essere usati per ulteriore purificazione della proteina, compreso frazionamento subcellulare o coimmunoprecipitation. Specifica fase di isolamento follicolo può essere utilizzato anche per saggi in vitro per lo sviluppo 7 e dal vivo-imaging 8. Isolato follicoli S10B-S13 continuerà a sviluppare per S14 in semplice terreni di coltura (vedi sotto). È importante notare che i follicoli S10A non progredire attraverso cella infermiera scarico utilizzando le condizioni di coltura discusse in questo manoscritto. Abbiamo usato S10B vitro di sviluppo nel definire il ruolo delle prostaglandine, sia farmacologicamente e geneticamente, nella regolazione actina rimodellamento utilizzando cellule infermiere dumping e di sviluppo che il read-out 7,9. Analogamente, le successive fasi di sviluppo possono essere isolati per determinare gli effetti dei trattamenti farmacologici o uomo geneticaipulations su particolari processi come la migrazione centripeta delle cellule, la migrazione appendice dorsale / 10 la formazione, e la morte cellulare infermiere. Tali saggi possono essere utilizzati per eseguire le schermate di interazione dominanti o saggi, ad esempio, mentre eterozigosi per mutazioni nel pxt o fascina da soli non hanno alcun effetto sulla S10B sviluppo in vitro, follicoli dei doppi eterozigoti cella infermiera mostra il dumping difetti e un blocco nello sviluppo 9. Inoltre, poiché S10B-13 può svilupparsi nella cultura, tutti i processi che si verificano durante questo periodo può essere osservato da live-imaging. Tale rappresentazione può essere eseguita semplicemente utilizzando luce trasmessa (se si è interessati solo a cambiamenti lordi in morfologia) o con la microscopia confocale utilizzando mosche transgeniche esprimenti sonde fluorescenti o follicoli colorati con coloranti di imaging dal vivo. L&#39;imaging dal vivo viene utilizzato per far avanzare notevolmente la nostra comprensione dei processi di sviluppo. Infatti, vivere imaging di follicoli in fase avanzata ha ampliato la conoscenza della migrazione appendice dorsale, un esempio di tubulogenesi 10. Ci aspettiamo che l&#39;imaging dal vivo di ulteriori processi tardivamente, comprese le dinamiche di actina durante la cella infermiere di dumping, fornirà nuove intuizioni in questi eventi evolutivi. E &#39;importante notare che mentre S10A e prime fasi di sviluppo del follicolo non continueranno a svilupparsi in un S14 in cultura, live-imaging di eventi che si verificano durante queste fasi di sviluppo è possibile utilizzando condizioni di coltura alternativi 11-14 (vedi la discussione per ulteriori informazioni). Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare i follicoli in fase avanzata sia per lo sviluppo in vitro e viviamo-imaging, o analisi molecolari (mRNA e isolamento proteine).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Drosophila oogenesi o lo sviluppo del follicolo è stato ampiamente utilizzato per far progredire la comprensione dei complessi processi biologici di sviluppo e cellulari. Questo documento descrive i metodi come isolare medio-tardiva follicoli fase (fase 10B-14) e di utilizzarle per fornire nuove intuizioni gli eventi molecolari e morfologiche che si verificano durante le finestre strette di tempo di sviluppo. Isolato follicoli possono essere utilizzati per una varietà di tecniche sperimentali, inclusi vitro nello sviluppo, l&#39;imaging dal vivo, analisi di espressione di mRNA e analisi western blot di proteine. Follicoli dello Stage 10B (S10B) o poi completare lo sviluppo in coltura, questo permette di coniugare perturbazioni genetiche o farmacologiche con lo sviluppo in vitro per definire gli effetti di tali manipolazioni sui processi che si verificano durante periodi specifici dello sviluppo. Inoltre, poiché questi follicoli si sviluppano nella cultura, sono l&#39;ideale per gli studi di imaging dal vivo, Che spesso rivelare nuovi meccanismi che mediano eventi morfologici. Isolato follicoli possono essere utilizzati anche per analisi molecolari. Per esempio, cambiamenti nell&#39;espressione genica che derivano da perturbazioni genetiche possono essere definiti per specifiche finestre di sviluppo. Inoltre, livello di proteine, stabilità, e / o stato modificazione post-traslazionale durante una particolare fase di sviluppo del follicolo possono essere esaminati mediante analisi Western blot. Pertanto, l&#39;isolamento specifico stadio di follicoli Drosophila fornisce una ricca fonte di informazioni in processi ampiamente conservate di sviluppo e morfogenesi.

Quando si isola specifici stadi di sviluppo del follicolo Drosophila è essenziale essere in grado di distinguere con precisione le diverse fasi morfologiche. Questo è piuttosto impegnativa per S10A e S10B, come le cellule infermiere e l&#39;ovocita ognuna metà della lunghezza del follicolo in queste fasi (Figura 1B rispetto a 1C). Tuttavia, follicoli S10A sono più corta follicoli S10B, come i follicoli S10B sono completamente allungati e quindi di lunghezza pari ad un folli...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.

L&#39;utilità della fase-specifici medio-tardiva<em&gt; Drosophila</em&gt; Follicolo isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K Views.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine. 

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Ricerca

Biologia

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualizzare il cuore pulsante di Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...