Questo lavoro è stato reso possibile attraverso il supporto alle infrastrutture operative del governo statale vittoriano e l'AUSTRALIAN Government NHMRC IRIISS e supportato dai finanziamenti del National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) e dell'Australian Research Council (KJH #FT190100265). Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto tecnico della Monash Animal Research Platform, monash Histology Platform e Monash Micro Imaging facility.

Le ovaie sono state raccolte da topi C57BL6J femminili. Tutte le procedure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Codice di condotta australiano NHMRC per la cura e l'uso degli animali e approvati dal Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
NOTA: Un agente chemioterapico ha dimostrato di esaurire gli ovociti follicoli primordiali, come determinato usando lastereologia 11 e il conteggiodiretto 12,13 è stato utilizzato in questo rapporto per confrontare i due metodi di conteggio nello stesso animale. I topi femmine di 8 settimane (giovani adulti) sono stati pesati prima di una singola iniezione intraperitoneale di 75 mg/kg/peso corporeo di ciclofosfamide o controllo del veicolo salino (n=5/gruppo). Questa dose ha dimostrato di causare un impoverimento approssimativo del 50% dei follicoli primordiali, ma non è stato riferito che causi morbilità o mortalità neitopi 14. Le ovaie sono state raccolte 48 ore dopo il trattamento. Un'ovaia di ciascun animale è stata fissata in soluzione di formalina tamponata neutra al 10% (v/v) per 24 ore e l'altra fissata nella soluzione di Bouin per 24 ore. Il tessuto è stato quindi incorporato nella resina glicolemetacrilato e sessato serialmente a 20 μm, oppure in paraffina e sessato serialmente a 5 μm. Tutti i tessuti erano macchiati di acido periodico Schiff ed ematossilina.
1. Preparazione istologica: fissazione, lavorazione, incorporamento e sessatura delle ovaie del topo
<ol><li>Sezionare le ovaie del topo tagliando l'ovidotto e tutto il grasso circostante, senza danneggiare o tagliare l'ovaio stesso. Se necessario, utilizzare un microscopio sezionato e una lama fine per questo passaggio (Figura 1A).</li>
	<li>Fissare immediatamente i tessuti posizionandoli in un piccolo tubo marcato contenente il fissatore (stereologia) di Bouin o il fissatore formalin (conteggi diretti) per 24 ore(Figura 1B),prima di trasferire i tessuti nel 70% di etanolo. NOTA: La morfologia follicolare è conservata al meglio all'interno del tessuto ovarico fisso di Bouin, incorporato nella resina glicolemetacrilato (Figura 2).</li>
	<li>Elaborare le ovaie fisse intere e quindi incorporare nella resina glicolemetacrilato per la stereologia (File complementare 1), o cera di paraffina per conteggi diretti utilizzando un protocollo istologico standard. ATTENZIONE: La resina è tossica, quindi assicurati che tutte le fasi di lavorazione dei tessuti vengano eseguite in un cappuccio dei fumi e che i guanti vengano indossati in ogni momento.</li>
	<li>Utilizzare un microtome specializzato in metacrilato di resina(Figura 1C)munito di un coltello di vetro(figura 1D)per tagliare in modo esaustivo sezioni di resina glicolemetacrilato spessa (ad esempio, 20 μm). Raccogliere le sezioni a intervalli regolari (ad esempio, ogni 3sezione rd) su vetrini al microscopio per stereologia.</li>
	<li>Utilizzare un microtomo standard per tagliare sezioni di paraffina sottili (ad esempio, 4-6 μm). Raccogliere sezioni di tessuto a intervalli regolari (ad esempio, ogni9 sezione) su un vetrino al microscopio in vetro per il conteggio diretto dei follicoli.</li>
	<li>Macchiare le diapositive con acido periodico Schiff ed ematossilina (File complementare 2).</li>
	<li>Coverslip con DPX standard per sezioni di paraffina o DPX spesso per sezioni di resina glicolemetacrilato (Figura 1E). ATTENZIONE: La resina glicolemetacrilato DPX è pericolosa, quindi eseguire questo passaggio nella cappa dei fumi. NOTA: La resina glicolemetacrilato DPX è estremamente viscosa. La coverlip di vetro deve essere aderendo saldamente premendola verso il basso con una spatola per garantire che il DPX sia uniformemente e sottilmente disperso e che non vi siano bolle d'aria presenti sotto il coverslip (Figura 1F).</li>
</ol>2. Stima stereologica del numero primordiale del follicolo utilizzando il frazionatore ottico
<ol><li>Accendere il computer, l'unità multicontrollo, la fotocamera e la sorgente luminosa all'interno della configurazione stereologica e impostare l'obiettivo del microscopio su un ingrandimento basso (ad esempio, 10x).</li>
	<li>Aprire il software di stereologia.</li>
	<li>Mettere la prima diapositiva in modo sicuro sul palco del microscopio.</li>
	<li>Regolare l'esposizione della luce controllando Automatico sotto Esposizione nel pannello Impostazioni fotocamera (Figura complementare 1A). In alternativa, regolare manualmente l'esposizione alla luce.</li>
	<li>Utilizzare il joystick per localizzare il primo campione di tessuto e mettere a fuoco il campione.</li>
	<li>Regolare il bilanciamento del bianco, facendo clic su Altre impostazioni (situato in basso a destra nel pannello Impostazioni fotocamera), quindi fare clic su Bilanciamento del bianco e fare clic su Automatico (Figura complementare 1B). In alternativa, fare clic sul pulsante Bilanciamento bianco adiacente al pulsante Altre impostazioni (o Seleziona area in altre impostazioni) per impostare manualmente il bilanciamento del bianco selezionando un'area bianca nella sezione.</li>
	<li>Passare al menu a discesa Probes e scegliere Workflow frazionatore ottico. Quindi fare clic su Avvia nuovo progetto e quindi su OK.
	<ol>
<li>Se è stata salvata una configurazione di campionamento esistente, in Parametri campionamento fare clic su Sì | ... e selezionare la configurazione di campionamento desiderata.</li>
		<li>In caso di meno, fare clic su No e immettere manualmente le informazioni sulla sezione seriale ( Figuracomplementare 1C) e definire la configurazione della sonda al passaggio 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Fate clic su Avanti (Next),impostate il microscopio su Ingrandimento basso (Low Magnification) e scegliete Ingrandimento 10x dal menu a discesa.</li>
	<li>Fare clic su Avanti, quindi tracciare l'intera sezione ovarica , iniziare facendo clic a sinistra intorno alla sezione e alla fine fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Chiudi contorno.</li>
	<li>Fate clic su Avanti (Next),impostate il microscopio su Ingrandimento elevato (High Magnification) e scegliete Ingrandimento olio 100x dal menu a discesa.</li>
	<li>Posizionare una goccia di olio sulla sezione tissutale sullo scivolo e spostare l'obiettivo del microscopio a un ingrandimento 100x.</li>
	<li>Regolare l'esposizione alla luce (come nel passaggio 2.4) e fare clic su Avanti.</li>
	<li>Impostate i parametri di campionamento per definire la configurazione del probe. Qui, il telaio di conteggio è stato impostato su 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2) e la lunghezza del passo è stata impostata su 100 μm x 100 μm (10.000 μm2)(Figura supplementare 2). Una volta stabiliti i parametri di campionamento, salvare il modello e riaprorlo durante le sessioni di analisi successive al passaggio 2.7.</li>
	<li>Fare clic su Inizia conteggio ( Figura complementare 1D). Mettere a fuoco la parte superiore dell'esempio, fare clic su OK e iniziare a contare.</li>
	<li>Utilizzare la manopola di messa a fuoco per muoversi attraverso la profondità di campionamento di 10 μm e contare tutti i follicoli primordiali il cui nucleo di ovocita viene messo a fuoco. Fare clic su Avanti per passare all'area successiva.<ol>
<li>Classificare i follicoli come primordiali se l'ovociti è circondato da cellule granulosa squamose (appiattite), ma nessuna cellule di granulosa cuboidale(Figura 2A). NOTA: I follicoli primordiali sono distinti dai follicoli intermedi/transitori, che comprendono una combinazione di cellule granulosa cuboidali e squamose (Figura 2B) e follicoli primari, che sono circondati prevalentemente da cellule granulosa cuboidali (Figura 2C). Queste classi follicoli devono essere quantificate separatamente.</li>
		<li>Conta solo i follicoli in cui è visibile il nucleo ovocita. Il nucleo di ovocita deve apparire all'interno del quadro di conteggio o toccare le linee di inclusione verde del quadro di conteggio (Figura supplementare 1E,F).</li>
		<li>Se il nucleo di ovocita cade al di fuori del telaio di conteggio (Figura supplementare 1G) o tocca le linee di esclusione rossa del telaio di conteggio, non contare questo follicolo.</li>
		<li>Quando si valuta l'esaurimento primordiale del follicolo in risposta a una sostanza chimica esogena (ad esempio, la chemioterapia), assicurarsi che tutti i follicoli contati siano sani e quindi abbiano una morfologia normale (Figura 2). Contare separatamente eventuali follicoli anomali o atretici. Spesso, la morte follicolare è indotta da insulti come la chemioterapia e la quantificazione dei follicoli atretici dovrebbe essere ottenuta separatamente al fine di distinguere tra follicoli sani e atretici, poiché solo i follicoli sani comprendono la riserva ovarica15.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta completato il conteggio su quella sezione, eseguire una delle operazioni seguenti:<ol>
<li>Fare clic su Aggiungi nuovasezione , quindi tornare al passaggio 2.3 per impostare la sezione successiva per il conteggio.</li>
		<li>Fare clic su Ho finito di contare per terminare la sessione. Riportare l'obiettivo a 10x, uscire dal software di stereologia e spegnere la sorgente luminosa, la fotocamera, l'unità multicontrollo e il computer.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottenere la somma del numero di follicolo grezzo (Q) da ogni sezione di tessuto campionare dall'intera ovaia, quindi utilizzando un foglio di calcolo, utilizzare l'equazione seguente per ottenere il valore finale da ogni animale replicato (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">dove: N = Numero totale stimato di follicoli all'interno dell'ovaio. Q = Conteggio primordiale dei follicoli grezzi. f1 = Intervallo di campionamento. Ogni sezione 3rd è stata campio campionare così <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> . f2 = Relazione tra il frame di conteggio (area campione) e il stepper, calcolato come <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . Poiché l'area del campione era di 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) e l'area del stepper era di 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . f3 = Frazione della sezione ovarica campionare. Poiché sono stati campionati 10 μm della sezione di 20 μm, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . Pertanto, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . NOTA: Questo protocollo descrive come applicare questi principi di analisi stereologiche utilizzando un software stereologico ampiamente citato (Table of Materials); tuttavia, sono disponibili altri software stereologici. I principi applicati durante le analisi stereologiche dei follicoli ovarico sono gli stessi, indipendentemente dal software utilizzato per impostare i parametri. La stereologia è più accurata quando 100 o più oggetti sono contati in un'ovaia di topo adulto4, in quanto ciò fornisce un coefficiente di errore per la stima inferiore al 10%16. I parametri di campionamento qui delineati sono stati ottimizzati per garantire che un minimo di circa 100 oggetti (cioè follicoli primordiali, transitori e primari) possano essere conteggiati nelle ovaie di tipo selvatico per adulti di tipo selvatico C57BL6J. È possibile condurre uno studio pilota che includa una piccola dimensione del campione per stabilire i parametri di campionamento ottimali, come l'intervallo e il numero di sezioni da analizzare e il numero di dissettori ottici all'interno delle sezionicampionare 17.</li>
</ol>3. Stima del numero primordiale del follicolo per conteggio diretto del follicolo ovarico
<ol><li>Posizionare il vetrino del microscopio in modo sicuro sotto un microscopio a luce standard ed eseguire conteggi diretti per ottenere il numero di follicolo primordiale grezzo.<ol>
<li>Classificare i follicoli come primordiali se l'ovociti è chiaramente visibile ed è circondato da cellule granulosa squamose (appiattite), ma nessuna cellule granulosa cuboidale(Figura 2D). NOTA: I follicoli primordiali sono distinti dai follicoli intermedi/transitori, che comprendono una combinazione di cellule granulosa cuboidale e squamosa (Figura 2E) e follicoli primari, che sono circondati prevalentemente da cellule granulosa cuboidali (Figura 2F). Queste classi follicoli devono essere quantificate separatamente.</li>
		<li>Assicurarsi che tutti i follicoli contati siano sani e abbiano quindi una morfologia normale (Figura 2). Contare separatamente eventuali follicoli anomali o atretici, poiché solo i follicoli sani comprendono la riserva ovarica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, prendi fotomicrografi multipli o cuciti ad alta potenza (ad esempio, 20 volte) dell'intera sezione del tessuto ovarico per eseguire conteggi aprendo i file di immagine. Questo può essere fatto manualmente o utilizzando uno scanner di diapositive automatizzato.</li>
	<li>Ottenere il numero di follicolo grezzo (Q) da ogni sezione tissutale campionato dall'intera ovaia all'intervallo predeterminato. Moltiplicare questo numero per l'inverso della frazione di campionamento per ottenere il valore finale per ogni animale replicato (N), usando l'equazione seguente. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">dove: N = Numero totale stimato di follicoli all'interno dell'ovaio. Q = Conteggio follicolo grezzo (di ogni singolo tipo, calcolato separatamente). f1 = Intervallo di campionamento. Ogni9° sezione è stata campionare così <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> . Pertanto, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo fornisce un protocollo passo-passo per la tecnica gold standard per l'enumerazione dei follicoli primordiali del topo, la stereologia e il metodo più comunemente utilizzato per il conteggio diretto dei follicoli. Il trattamento chemioterapico è stato utilizzato per confrontare e confrontare i risultati ottenuti da questi due diversi metodi all'interno dell'ovaio sinistro e destro dello stesso animale. Entrambi i metodi hanno rivelato un'elevata variabilità tra gli animali nei numeri primordiali del fol...

Gli ovociti immaturi, arrestati meioticamente immagazzinati all'interno di follicoli primordiali nell'ovaio sono l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile e comprendono la riserva ovarica a vita di un individuo. Il numero primordiale di follicoli diminuisce naturalmentecon l'età di 1, o in alternativa, può essere prematuramente impoverito a seguito dell'esposizione a sostanze chimiche esogene, tra cui alcuni prodotti farmaceutici e sostanze tossiche ambientali nell'aria, negli alimenti enell'acqua 2. Dato che il numero primordiale del follicolo è finito, la quantità e la qualità dei follicoli presenti all'interno dell'ovaio determinano in gran parte la fertilità femminile e la salute della prole. Pertanto, una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne è essenziale per valutare gli impatti fuori bersaglio degli insulti esogeni sulla riserva ovarica.
Nelle donne, l'analisi dell'intera ovaia non è generalmente possibile, quindi le misure surrogate non invasive della riserva ovarica devono essere utilizzate in un ambiente clinico. L'Mϋllerian anti-Mϋllerian (AMH) è il biomarcatore surrogato più utilizzato clinicamente3. I livelli di AMH sierico sono spesso misurati nelle donne in età materna avanzata, o prima e dopo il trattamento del cancro, come la chemioterapia. Tuttavia, l'AMH è prodotto dalla crescita dei follicoli e non dai follicoli primordiali, e quindi, i livelli del siero non informano sul numero primordiale assoluto del follicolo.
Con l'assenza di metodi per determinare con precisione il numero primordiale di follicoli nelle donne in situ, il conteggio dei follicoli ovarico in piccoli modelli animali, come i roditori, rimane uno strumento di ricerca essenziale per valutare il grado in cui gli insulti esogeni hanno un impatto sui follicoli primordiali e quindi sulla fertilità. Sfortunatamente, tuttavia, i rapporti in tutta la letteratura sui numeri primordiali dei follicoli nei modelli di roditori sono altamentevariabili 4. Una delle ragioni principali di ciò sono le differenze tecniche ampiamente riportate nel metodo di conteggio utilizzato. Prevalentemente, ci sono due diverse tecniche descritte nella letteratura per enumerare i follicoli primordiali nei topi. Questi includono la stereologia, che utilizza il metodo del dissector ottico del frazionatore, e il conteggio diretto dei follicoli.
La stereologia è ampiamente considerata il gold standard in quanto utilizza un campionamento casuale uniformesistematico 5, rendendolo il metodo più accurato per quantificare il numero primordiale del follicolo nell'intero topo, o ovaiedi ratto 4,6,7. La stereologia è imparziale, in quanto spiega la struttura tridimensionale dell'oggetto di interesse8. Utilizzando un metodo di dissector/frazionatore ottico, vengono applicati tre livelli di campionamento per quantificare i follicoli primordiali utilizzando sezioni di tessuto spesse (ad esempio, 20 μm) all'interno di una frazione nota dell'ovaio totale del topo. In primo luogo, l'intervallo di campionamento viene scelto (ad esempio, ogni 3rd section) ad un inizio casuale (frazione di campionamento 1, f1)4. Le sezioni vengono quindi campionare in modo sistematico e uniforme da questo punto attraverso l'intera ovaia. Quindi, un sistema di conteggio imparziale viene sovrapposto alla sezione ovarica e progressivamente spostato lungo una griglia di conteggio definita e randomizzata (frazione di campionamento 2, f2)8. Infine, una frazione nota dello spessore della sezione viene campionato otticamente (ad esempio, 10 μm) e vengono conteggiati i follicoli all'interno di quest'area (frazione di campionamento 3, f3)4. Il numero del follicolo grezzo viene moltiplicato per l'inverso di queste frazioni di campionamento per ottenere il valore finale. Questo metodo richiede una formazione e attrezzature esperte, incluso un microscopio con uno stadio motorizzato guidato da software stereologico. I tessuti devono essere conservati in un fixativo di Bouin specializzato e incorporati nella resina glicolemetacrilato per consentire il taglio di sezioni di tessuto spesse utilizzando un microtomo di resina glicolemetacrilato con un coltello di vetro. Questo metodo è progettato per tenere conto del restringimento e della deformazione tissutale, per preservare al meglio la struttura morfologica tridimensionale dell'ovaio e dei follicoli9.
Il conteggio diretto dei follicoli è il metodo più utilizzato per contare ifollicoli 10. Possono essere utilizzati fissivi più comuni (cioè formalina), seguiti da incorporamento di cera di paraffina e sessatura seriale esaustiva utilizzando un microtomo standard con uno spessore compreso tra 4-6 μm. I follicoli vengono sistematicamente conteggiati nell'intera sezione tissutale ad un intervallo definito, e quindi moltiplicati per l'inverso dell'intervallo di campionamento per ottenere la stima totale del follicolo. Questo metodo è rapido, facile, può essere eseguito utilizzando tessuti archiviati e preparato utilizzando tecniche istologiche standard. Richiede solo un microscopio a luce con funzionalità di imaging standard. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, il conteggio diretto dei follicoli manca dell'accuratezza e dei rigorosi parametri di conteggio della stereologia, rendendolo più incline ai pregiudizi degli investigatori. Inoltre, i tessuti possono subire restringimento e deformazione durante la lavorazione, interrompendo l'integrità e la morfologia dell'ovaio e rendendo così difficile la classificazione e la quantificazione dei follicoli.
Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere due metodi comunemente usati per valutare quantitativamente il numero primordiale di follicoli nelle ovaie del topo: stereologia e conteggio diretto dei follicoli. Forniremo protocolli dettagliati per questi due metodi ed evidenzieremo alcuni dei loro punti di forza e di debolezza, al fine di migliorare la riproducibilità nel nostro campo e consentire ai ricercatori di prendere una decisione informata sul metodo di conteggio più appropriato per i loro studi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Mammiferi femminili che si riproducono sessualmente nascono con tutta la loro fornitura di ovociti per tutta la vita. Gli ovociti immaturi e quiescenti si trovano all'interno dei follicoli primordiali, l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile. Non sono rinnovabili, quindi il loro numero alla nascita e il conseguente tasso di perdita dettano in gran parte la durata fertile della vita femminile. Una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne e negli animali è essenziale per determinare l'impatto di medicinali e sostanze tossiche sulla riserva ovarica. È anche necessario valutare la necessità e il successo delle tecniche di conservazione della fertilità esistenti ed emergenti. Attualmente, non esistono metodi per misurare con precisione il numero di follicoli primordiali che comprendono la riserva ovarica nelle donne. Inoltre, ottenere tessuto ovarico da grandi animali o specie in via di estinzione per la sperimentazione spesso non è fattibile. Pertanto, i topi sono diventati un modello essenziale per tali studi e la capacità di valutare i numeri primordiali dei follicoli nelle ovaie del topo intero è uno strumento critico. Tuttavia, i rapporti sui numeri assoluti dei follicoli nelle ovaie di topo in letteratura sono altamente variabili, rendendo difficile confrontare e / o replicare i dati. Ciò è dovuto a una serie di fattori tra cui tensione, età, gruppi di trattamento, nonché differenze tecniche nei metodi di conteggio impiegati. In questo articolo, forniamo una guida didattica passo-passo per preparare sezioni istologiche e contare follicoli primordiali nelle ovaie di topo usando due metodi diversi: [1] stereologia, che si basa sulla tecnica del frazionamento / dissector ottico; e [2] la tecnica del conteggio diretto. Alcuni dei principali vantaggi e svantaggi di ciascun metodo saranno evidenziati in modo da migliorare la riproducibilità sul campo e consentire ai ricercatori di selezionare il metodo più appropriato per i loro studi.

È stato utilizzato un modello ben caratterizzato di esaurimento del follicolo, in base al quale alle giovani topi adulte è stata somministrata una singola dose di chemioterapia ciclofosfamide, o controllo saline del veicolo (n = 5 / gruppo) ed entrambe le ovaie sono state raccolte da ogni animale dopo 48 ore. Un'ovaia per animale è stata preparata come descritto nel passaggio 1 per ciascuno dei due metodi: stereologia o conteggi diretti. L'ovaio sinistro e destro di ogni animale è stato assegnato casualmente a ciascu...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

accurate-follicle-enumeration-in-adult-mouse-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Views.  Monash University. Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Video: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Methods Article

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto