Questo protocollo è significativo perché è un metodo optogenetico, o attivato dalla luce, per indurre l'espressione genica, in un organismo intatto. Nel nostro caso, un embrione di zebrafish. Il vantaggio di questa tecnica, è che utilizza la luce, come agente induttore, che consente un controllo molto preciso, spaziale e temporale dell'induzione.
Questo protocollo sarebbe utile per qualsiasi situazione in cui l'espressione genica inducibile sarebbe utile. Ciò include cose come il tracciamento del lignaggio, i saggi di guadagno di funzione o gli esperimenti di salvataggio. Per iniziare posiziona il pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti embrioni per fornire 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di potenza di luce a più embrioni contemporaneamente.
Per ridurre il rischio di danni fotografici all'attivatore trascrizionale della coda, inviare la luce a intervalli di un'ora on-off utilizzando un relè timer, se si illumina per più di tre ore. Rimuovere i coperchi della capsula di Petri per ridurre al minimo la dispersione della luce dalla condensa. Posizionare le piastre di Petri contenenti embrioni di controllo e una scatola a prova di luce per i controlli scuri.
Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione, dopo la durata di attivazione desiderata. Per l'estrazione totale dell'RNA, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA. Trasferire gli embrioni in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri e rimuovere l'acqua dell'uovo in eccesso.
Dopo aver aggiunto il tampone di lisi, omogeneizzare gli embrioni con il pestello di plastica. Trasferire il lisiato in una colonna fornita dal kit e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA. Conservare l'RNA purificato, a meno 20 a meno 80 gradi Celsius, fino all'uso o sintetizzare immediatamente il cDNA da un microgrammo, RNA totale utilizzando il kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.
Aggiungere un microgrammo di RNA in una parete sottile da 0,2 millilitri, tubo PCR, contenente quattro microlitri, di cinque volte la miscela master di reazione cDNA, seguita dall'aggiunta di un microlitro, di 20 volte soluzione enzimatica di trascrittasi inversa. Successivamente compongono un volume finale di 20 microlitri, con acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo in un termocicclatore programmato per la sintesi del cDNA.
Conservare il cDNA sintetizzato a meno 20 gradi Celsius fino all'uso o utilizzare immediatamente per la valutazione quantitativa. Impostare le reazioni quantitative PCR contenenti cyber green enzyme master mix. CDNA e GFP primer a 325 nanomolari a 325 nanomolari in triplicati e conducono la reazione in una macchina PCR programmata in tempo reale.
Al termine della reazione, analizzare la curva di fusione per determinare la specificità della reazione. Calcola l'induzione attivata dalla luce come cambiamento di piega rispetto agli embrioni di controllo utilizzando il metodo della doppia TC Delta. E utilizzare software statistico per determinare la significatività.
Dopo aver rimosso gli embrioni dall'illuminazione, immobilizzare gli embrioni per l'imaging in 3% di metilcellulosa contenente lo 0,01% di tricaina in vetrini di depressione di vetro. Acquisisci immagini a fluorescenza e in campo luminoso su uno stereomicroscopio fluorescente collegato a una fotocamera digitale utilizzando le impostazioni standard del filtro GFP. Unisci immagini brightfield e fluorescenza dopo l'acquisizione con il software di elaborazione delle immagini.
La quantificazione dell'espressione GFP indicava l'induzione dell'espressione non appena 30 minuti dopo l'esposizione alla luce blu. I livelli di espressione della GFP hanno poi continuato ad aumentare fino a sei ore, post-attivazione costantemente. L'induzione della GFP è stata anche valutata qualitativamente esaminando l'intensità della fluorescenza nei punti di tempo post-attivazione.
La fluorescenza della GFP al di sopra dei livelli di fondo è stata osservata per la prima volta a tre ore dopo l'attivazione ed è diventata notevolmente più luminosa a sei ore dopo l'attivazione. Al contrario, gli embrioni di controllo per tutti i punti temporali, tenuti al buio, non mostravano alcuna apprezzabile fluorescenza GFP. La luce attivante deve essere nell'intervallo blu dello spettro della luce visibile.
Sia la luce della stanza che la luce del sole contengono un po 'di luce blu. Quindi fai attenzione a proteggere i tuoi controlli negativi da qualsiasi fonte di luce ambientale. Il sistema TAEL C120, è geneticamente codificato e modulare e può guidare l'espressione di qualsiasi gene di interesse.
Quindi, combinato con altre tecniche, può essere utilizzato per rispondere a una serie di domande biologiche.
