Questo metodo consente la cattura imparziale dell'espressione genica della microglia a un livello a singola cellula, che può aiutare a chiarire l'eterogeneità molecolare delle microglia in un cervello sano e mato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una procedura dettagliata per un rapido isolamento delle microglia da diverse regioni cerebrali e mostra come generare in modo efficiente la base di riproduzione delle librerie RA6 a cella singola per il sequenziamento profondo. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer e le soluzioni necessari come delineato nel protocollo di testo e raffreddarli sul ghiaccio.
Dopo aver eutanasiato e decapitato il topo, usa piccole forbici per aprire la pelle sulla testa per esporre il cranio sottostante. Quindi, tagliare la sutura sagittale, la sutura lambdoidale e la sutura coronale. Utilizzare le forcelle per estrarre entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto e spostare attentamente il cervello in una piastra di Petri di dissezione contenente il mezzo A.Utilizzando una lama pre-refrigerata, tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi.
Utilizzare le forcep numero 55 per separare il cervelletto dal lobo corticale e dal tronco encefalico. Quindi, utilizzare le forcelle numero 55 per sezionare attentamente l'ippocampo e lo striato dalla corteccia e trasferire ogni tessuto in una piastra di Petri di raccolta separata. Per prima cosa, usa una lama di rasoio per tagliare ogni regione cerebrale in pezzi fini inferiori a un millimetro cubo.
Utilizzando una pipetta da un millilitro con la punta tagliata, trasferire i pezzi di tessuto in omogeneizzatori Dounce pre-refrigerati. Omogeneizzare il tessuto ruotando lentamente il pistone all'interno e all'uscita dall'omogeneizzatore Dounce per sei-10 tratti completi fino a quando non sono presenti pezzi visibili. Quindi, trasferire i tessuti dissociati in tubi da 50 millilitri attraverso filtri da 70 micrometri.
Risciacquare ogni omogeneizzatore e pistone Dounce con un totale di sei millilitri di mezzo freddo A, quindi trasferire il risciacquo in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Centrifuga la sospensione a cella singola a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti con una pausa a cinque. Risciacquare una grande colonna di esaurimento e tre grandi colonne di selezione in un separatore magnetico con tre millilitri di MCS.
Quando la centrifugazione per i campioni di tessuto è completa, pipettare fuori e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimescolare le cellule nel buffer MCS che contiene l'inibitore della RNasi. Aggiungere 100 microlitri di perline di rimozione della mielina a ciascun tubo contenenti cellule ri-sospese dalla corteccia e dal cervelletto e aggiungere 50 microlitri di perline di rimozione della mielina a ciascuno dei tubi contenenti cellule ri-sospese dall'ippocampo e dallo striato.
Incubare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, aggiungere MCS al tubo contenente celle corticali per portare il suo volume fino a due millilitri e ai tubi rimanenti per portare ciascuno dei loro volumi fino a un millilitro. Una volta che le colonne sono vuote di tampone di risciacquo, caricare due millilitri di celle corticali sulla colonna di esaurimento di grandi dimensioni e un millilitro l'uno dell'altro sospensione cellulare su colonne di selezione di grandi dimensioni separate.
Successivamente, lavare quelli di grandi colonne di esaurimento con un millilitro di buffer MCS e lavare due volte ogni colonna di selezione di grandi dimensioni utilizzando un millilitro di buffer MCS per ogni lavaggio. Filtrare le celle attraverso tappi filtranti a 35 microliter in tubi FACS a fondo tondo. Centrifuga questi tubi a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare le cellule.
Quindi, versare lentamente il supernatante e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Rimospendare le celle in ogni tubo con 300 microlitri di tampone FACS. In primo luogo, aggiungere cinque microlitri dei recettori FC del mouse bloccano il reagente a ciascun tubo.
Incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, aggiungere un microlitro di FORMATO CD45 PE sette e un microlitro di CD11B BV421 a ciascun tubo. Incubare i tubi su uno shaker a temperatura ambiente per 10 minuti.
Dopo questo, aggiungere due millilitri di tampone FACS da lavare. Centrifugare a 400 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti per pellettare le cellule. Rimescolare le cellule in ogni tubo con 400 microlitri di tampone FACS contenenti un microlitro di inibitore della RNasi e 0,5 microlitri di ioduro di propidio.
Seguendo la procedura FACS standard, ordinare singole microglia vive con un ugello da 100 micrometri in piastre PCR da 96 po 'che contengono quattro microlitri di tampone di lisi in ogni pozzo. Vortice brevemente le piastre e farle girare verso il basso usando una centrifuga da banco. Conservare le piastre a meno 80 gradi Celsius fino alla preparazione della libreria.
Quando è pronto per procedere, scongelare il piatto sul ghiaccio. Utilizzare un ciclore termico per eseguire una prima trascrizione per generare cDNA e amplificare il cDNA con un ulteriore passaggio di digestione dell'esonucleasi come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, purificare il cDNA aggiungendo 18 microlitri di perline magnetiche ad ogni pozzo.
Incubare la piastra su un supporto magnetico per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e lavare i campioni due volte con etanolo appena fatto all'80% utilizzando 80 microlitri di etanolo per pozzo per ogni lavaggio. Per eseguire la tagmentazione, utilizzare una pipettatrice nanoliter per mescolare 0,4 microlitri di ogni campione di cDNA con 1,2 microlitri di reagenti di tagmentazione Tn5 dal kit di preparazione della libreria in una piastra da 384 pozzetti a 55 gradi Celsius per 10 minuti.
Per interrompere la reazione di tagmentazione, aggiungere 0,4 microlitri di tampone di neutralizzazione a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, con 384 indici e 1,2 microlitri di PCR mescolati ai campioni e amplificando le librerie come delineato nel protocollo di testo. Raggruppa tutte le singole librerie dalla stessa piastra da 384 po 'e usa perline magnetiche per purificare le librerie in pool finali.
In questo studio, le microglia sono isolate dalla corteccia, dal cervelletto, dall'ippocampo e dallo striato dell'emisfero cerebrale di un topo adulto. La sospensione cellulare preparata viene esaminata al microscopio utilizzando tripano blu e un emocitometro per stimare la resa, la vitalità cellulare e l'efficacia della rimozione della mielina prima di eseguire la colorazione degli anticorpi. Il numero totale di cellule a questo punto dovrebbe essere superiore a 30.000 per la corteccia e oltre 5.000 per gli altri tessuti.
Oltre il 90% delle cellule dovrebbe essere vitale con piccoli detriti di mielina. Una macchina FACS viene utilizzata per ordinare le microglia, che sono tipicamente cd45 basse e CD11B positive. Un isolamento riuscito dovrebbe generare oltre l'80% di microglia da tutte le singole cellule vive, almeno per il tessuto corticale.
Una volta che le singole microglia vengono catturate nel buffer di lisi, l'RNA viene rilasciato e successivamente trascritto in cDNA, che viene quindi amplificato per 23 cicli. Come piattaforma capillare di elettroforesi, l'analizzatore di frammenti e i kit di frammenti NGS ad alta sensibilità forniscono informazioni rapide e accurate sulla distribuzione delle dimensioni, nonché sulla quantità di molecole di cDNA presenti in ogni pozzo di una piastra da 96 porri. Campioni che mostrano uno striscio compreso tra 500 e 5.000 coppie di basi e sono al di sopra di una certa soglia di concentrazione possono essere utilizzati per creare librerie.
I campioni vengono sequenziati a una profondità di oltre un milione di letture grezze per cella, che satura il potere di rilevamento della metodologia di sequenziamento dell'RNA a singola cella. Con un tasso di mappatura di circa il 60% su 2.000 geni possono essere rilevati per cellula microgliale. I dati pubblicati in precedenza generati da questo metodo di isolamento sono riprodotti da esperimenti indipendenti, dimostrando la sensibilità per il rilevamento di geni specifici di microglia attraverso la popolazione sequenziata.
Con le informazioni delle trascrizioni di singole microglia, i ricercatori possono scoprire le popolazioni cellulari uniche nel contesto del loro interesse e studiare ulteriormente la rilevanza funzionale di queste popolazioni appena identificate.
