Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande nel campo del metodo di malignità sulla caratterizzazione di una cellula che inizia una malignità. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una base per l'analisi funzionale di queste cellule staminali tumorali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono dove la terapia delle sindromi mielodisplastiche o MDS, in quanto può aiutare nell'identificazione delle cellule che iniziano la malattia.
Per preparare i destinatari al trasferimento adottivo, una settimana prima del trapianto fornire acqua sterile integrata con 100 milligrammi per litro di ciprofloxacina agli ANIMALI riceventi congeni per sette giorni in una struttura animale specifica e priva di agenti patogeni. Il settimo giorno, un operatore qualificato e certificato di cesio 17 ha impostato lo strumento sorgente di cesio per fornire 70 centigrays di irradiazione gamma corporea totale al minuto. Posizionare 10 topi in un supporto progettato su misura.
Inserire il supporto nella camera dell'irradiatore, fornire 9 grigi di irradiazione totale del corpo in 13 minuti. Quindi riportare gli animali nelle loro gabbie. La mattina dopo, spruzzare il 70% di etanolo su un intero topo C57 nero da due a sei falena e usare le forbici per rimuovere la pelle dal bacino alle caviglie.
Usa le flessidi con le forbici per rimuovere la femora e le tibiae. Tagliare in modo pulito i muscoli dalle ossa. Tagliare le estremità prossimali e distali per le tibiae e raccogliere una tibia con le forcep.
Inserire una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 27 gage nella cavità del midollo osseo e sciacquare il midollo osseo in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri contenente 2,5 millilitri di soluzione salina tamponata Hanks integrata con siero bovino fetale al 2% o HF2. Quando tutto il midollo è stato raccolto, aspirare il tessuto più volte attraverso la punta dell'ago da 20 gage per disperdere la massa del midollo in un'unica sospensione per il conteggio. Per etichettare le cellule nucleate del midollo osseo, o BMNC, per lo smistamento del flusso, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere il pellet a una volta per dieci al settimo BMNC per 90 microlitri di concentrazione di HF2.
Successivamente, aggiungere dieci microlitri di un cocktail anticorpale biotinilato e anti-lignaggio alla sospensione cellulare per un'incubazione di 20 minuti a 4 gradi Celsius. Seguito da un lavaggio centrifuga in tre millilitri di PBS. Sospendere di nuovo il pellet in 100 microlitri di HF2 per una per dieci fino alla settima cellule.
Etichettare secondariamente le cellule con due microlitri di anticorpo anti biotina coniugato APC. Dopo 20 minuetti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, lavare le cellule in tre millilitri di PBS fresco. Sospendere nuovamente il pellet in HF2 integrato con 0,2 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio sul ghiaccio.
Ora calibrate lo smistatore di celle di citometria a flusso utilizzando celle non macchiate per ottimizzare tutti i parametri di tubi fotomoltiplicatori, dispersione e fluorescenza all'interno dell'intervallo lineare di ogni rivelatore. Acquisire tre campioni di 10.000 celle per le celle etichettate APC senza etichetta, PI etichettate e anti-lignaggio. Alla fine dell'ordinamento, analizzare 1.000 celle da ogni campione per confermare la purezza e la vitalità delle celle ordinate.
Spin giù i campioni nella centrifuga. Quindi sospendere di nuovo i pellet in 0,5 millilitri di HF2 per il conteggio. Per il trasferimento adottivo delle cellule selezionate, mescolare 100 microlitri di due volte il BMNC di tipo selvatico da un animale ricevente congene in HF2 sterile.
Con 100 microlitri da due a cinque per dieci al quarto il donatore smistato BMNC di interesse per l'HF2 sterile in un tubo di micro centrifuga per animale ricevente. Caricare una siringa millilitro, dotata di un misuratore da 28 gage per ricevente con 200 microlitri di cellule. Quindi, posizionare i topi ricevente sotto una lampada termica per indurre la dilatazione della vena della coda.
Consegnare le miscele cellulari a ciascun animale ricevente irradiato letale attraverso la vena della coda. Poiché l'autorinnovimento delle cellule staminali è limitato al lignaggio negativo BMNC di tipo selvatico, il lignaggio negativo, il basso lignaggio positivo e le cellule positive ad alta discendenza vengono ordinate e trapiantate in destinatari di tipo selvaggio per determinare la capacità di autori ricambio di ogni popolazione cellulare. Il BMNC trans genetico donatore trapiantato adottivamente da animali modello MDS può essere distinto ex vivo per la loro espressione marcatore di superficie cellulare CD45.2.
Entro 16 settimane dal trapianto di BNMC negativo di lignaggio, o BMNC non di assortimento da animali donatori di MDS transgenici, le cellule transgeniche fuori competono con le cellule di tipo selvatico come evidenziato da una percentuale crescente di cellule donatrici positive CD45.2, osservate nel sangue periferico degli animali riceventi irradiati letale. Qui vengono mostrate cellule da una trasformazione leucemica da un topo trapiantato con cellule MDS transgeniche. Si noti la presenza di numerose esplosioni e forme immature.
Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di limitare il tempo di manipolazione ex vivo, in quanto può posizionare stress indebito sulle cellule, con conseguente morte cellulare o perdita funzionale. Dopo lo sviluppo questa tecnica apre la strada ai ricercatori del programma sul campo, per mettere in malignità per esplorare la fonte della malattia nei topi geneticamente modificati.
