Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano durante la normale differenziazione mieloide delle cellule ematopoietiche positive ematopoietiche umane CD34. Il vantaggio principale di questo protocollo è che permette la differenziazione delle cellule positive CD34 lungo tutte e quattro le lignaggi mieloidi tra cui megacariociti, eriociti, granulociti e monociti. A dimostrare la procedura sarà Aditi Bapat, un post-doc del mio laboratorio.
Per l'isolamento delle cellule mononucleari da un campione di sangue del cordone ombelicale umano, sterilizzare la superficie esterna di un sacchetto di sangue del cordone ombelicale con il 70% di etanolo prima di trasferire il contenuto del sacchetto in una bottiglia di plastica sterile da 250 millilitri all'interno di un armadietto di sicurezza biologico. Diluire il sangue con un volume uguale di soluzione salina tamponata di Hank a temperatura ambiente e aggiungere 15 millilitri di mezzo di frazionamento cellulare mononucleare a ciascuno dei cinque tubi conici sterili da 50 millilitri. Dopo una miscelazione delicata, versare con cura 30 millilitri del sangue diluito del cordone ombelicale sul mezzo di frazionamento mononucleare in ogni tubo, tenendo i tubi da 50 millilitri ad angolo per evitare di mescolare gli strati.
Separare le cellule per centrifugazione del gradiente di densità e rimuovere i primi 15-20 millilitri di plasma sopra lo strato di cellule mononucleari. Utilizzare una pipetta per trasferire accuratamente lo strato di cellule mononucleari esposte in un nuovo tubo da 50 millilitri, raggruppando le celle mononucleari da due a tre tubi insieme e portare il volume finale in ogni tubo fino a 50 millilitri con tampone PBE freddo. Pellettizzare i campioni di cellule mononucleari per centrifugazione e aspirare i supernatanti.
Toccare delicatamente ogni tubo per allentare il pellet cellulare e diluire il pellet in cinque millilitri di tampone PBE ghiacciato. Unire le celle da tre a quattro tubi in un tubo conico da 50 millilitri e lavare tutti i tubi con cinque millilitri di tampone PBE fresco per raccogliere tutte le celle rimanenti. Dopo il conteggio, portare il volume finale nel tubo fino a 50 millilitri con tampone PBE freddo di ghiaccio fresco e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Per isolare le cellule mononucleari positive CD34, sospendere di nuovo il pellet in 50 millilitri di tampone PBE fresco prima di raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. Dopo aver scartato il supernatante, toccare delicatamente per allentare il pellet e sospendere di nuovo le cellule a una volta 10 per le otto celle mononucleari per 300 microlitri di concentrazione tampone PBE ghiacciata. Bloccare qualsiasi legame non specifico con 100 microlitri del recettore Fc che blocca il reagente, mescolare delicatamente, quindi aggiungere 100 microlitri di microperline CD34 da un kit di microperline CD34 umano attivato magnetico per uno per 10 alle otto cellule con miscelazione delicata e incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Durante l'incubazione delle cellule, posizionare una colonna LS e un filtro di pre-separazione in un campo magnetico separatore MACS. Equilibrare la colonna con due millilitri di tampone PBE ghiacciato e il filtro di pre-separazione con un millilitro di tampone. Lasciare svuotare la colonna in un tubo conico da 15 millilitri e scartare il flusso.
Al termine dell'incubazione, portare il volume finale del campione di cellule mononucleari fino a 15 millilitri con tampone PBE freddo ghiaccio fresco e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di tampone PBE ghiacciato e caricare le celle sul filtro di pre-separazione sulla colonna. Risciacquare il tubo con tre millilitri di tampone PBE freddo ghiaccio fresco e aggiungere il tampone al filtro di pre-separazione.
Lavare la colonna quattro volte con altri tre millilitri di tampone PBE ghiacciato per lavaggio senza filtro, consentendo alla colonna di drenare completamente tra ogni lavaggio. Dopo il lavaggio finale, spostare la colonna in un nuovo tubo da 15 millilitri e immergere cinque millilitri di PBE fresco ghiacciato attraverso la colonna nel tubo. Per determinare le frazioni delle popolazioni staminali e progenitrici nelle cellule staminali ematopoietiche positive cd34 appena isolate e nelle cellule progenitrici, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere il pellet a una volta per 10 alle sei cellule per 50 microlitri di concentrazione del buffer di citometria del flusso.
Successivamente, trasferire le cellule in aliquote di 50 microlitri per tubo di smistamento cellulare attivato a fluorescenza di cinque millilitri secondo il protocollo sperimentale di colorazione citometrica del flusso. Aggiungere il cocktail anticorpale appropriato e la colorazione viva /morta alle cellule, regolando il volume a 100 microlitri totali. Dopo 20 minuti al buio protetti dalla luce, lavare le cellule con un millilitro di tampone di citometria a flusso fresco per tubo e sospendere di nuovo le cellule in 500 microlitri di tampone di citometria a flusso fresco per tubo.
Quindi analizzare le cellule su un citometro di flusso in base ai protocolli citometrici a flusso standard. Per differenziare le cellule staminali e progenitrici positive CD34 isolate da microperline in cellule di lignaggio mieloide, rivestire prima i pozzi di una piastra sterile a 48 poggia-porcile non rivestita con 200 microlitri per pozzo di soluzione di fibronectina umana ricombinante in PBS per due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, scartare la soluzione di fibronectina da ogni pozzo e bloccare i pozzi con 200 microlitri di albumina siere bovina al 2%.
Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare i pozzi due volte con 500 microlitri di PBS sterile per lavaggio. Sospendere di nuovo le cellule positive CD34 appena isolate a cinque volte 10 le cinque cellule per millilitro di concentrazione media di stimolazione calda. Successivamente, seminare 200 microlitri di cellule in ogni pozzo della piastra rivestita con frammento di fibronectina e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore.
Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule con una delicata pipettazione e lavare i pozzi con 500 microlitri del mezzo Eagle modificato di Dulbecco riscaldato, raggruppando i lavaggi con la sospensione cellulare. Dopo il conteggio, sospendere di nuovo le cellule a una concentrazione media di differenziazione mieloide 2,5 per 10 per ogni millilitro di concentrazione media di differenziazione mieloide. Strato 200 microlitri di cellule positive CD34 per pozzo in una piastra di coltura del tessuto del tessuto del pozzo semi di cellule stromali MS-5.
Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare, sostituendo delicatamente 100 microlitri del supernatante in ogni pozzo con 100 microlitri di mezzo di differenziazione mieloide fresco 2X ogni tre o quattro giorni. Il giorno 21, raccogliere le cellule per l'analisi dell'espressione del marcatore di lignaggio mieloide per citometria del flusso come appena dimostrato. La percentuale tipica di cellule positive totali del CD34 isolate dal sangue del cordone ombelicale per separazione delle microperline, come dimostrato, varia tra l'80 e il 90% L'analisi immunofenotipico rivela che queste cellule positive cd34 consistono tipicamente in una popolazione di cellule staminali ematopoietiche negative cd34 positiva cd34 positiva del 20% e una popolazione positiva di cellule progenitrici cd38 positive cd34.
All'interno della multi-potente popolazione di cellule progenitrici, circa il 25% delle cellule esprime marcatori progenitori mieloidi comuni, circa il 15% esprime marcatori progenitori monociti granulociti e circa il 56% esprime marcatori progenitori eriotiroidi megacariociti. L'immunofenotipizzazione dimostra anche che la percentuale di cellule positive cd34 si riduce da circa il 90% all'isolamento a meno del 25% il giorno 21. L'analisi della popolazione negativa del CD34 mostra un aumento concomitante della percentuale di cellule che esprimono marcatori di lignaggio mieloide maturi.
Inoltre, le cellule macchiate wright-giemsa dimostrano caratteristiche morfologiche distinte nei primi giorni e 21 con le colture indifferenziate che mostrano nuclei grandi e rotondi e pochissimo citoplasma e le colture differenziate che mostrano caratteristiche morfologiche delle cellule di lignaggio tra cui monociti, granulociti ed erioblasti. Ricordarsi di versare il sangue del cordone diluito sul mezzo di frazionamento cellulare mononucleare senza mescolare gli strati e non disturbare le cellule positive MS-5 e CD34 quando si cambia il mezzo. Seguendo questo protocollo di differenziazione, le colture cellulari positive CD34 possono essere analizzate per cambiamenti morfologici, effetti apoptotici, cambiamenti nei modelli del ciclo cellulare e il grado di differenziazione.
