Questo lavoro è stato supportato da un &#39;Grant in Aid di Ricerca&#39; dal morbo di Crohn e Colite Foundation del Canada LMS, che è supportato da una Canadian Association of Gastroenterology / Canadian Association of Health s Research / Crohn &#39;e Colite Fondazione Premio Canada Investigator Nuovo.

1. I macrofagi riducono Utilizzo clodronato contenenti liposomi <ol><li> I liposomi vengono conservati a 4 ° C. Due ore prima dell&#39;iniezione, rimuovere clodronato contenenti liposomi, PBS contenenti liposomi, o PBS sterile (iniezione controllo) dal frigorifero per consentire loro di la temperatura ambiente (18 ° C). </li><li> Invertire le provette contenenti liposomi 8-10 volte per assicurare una distribuzione uniforme prima di caricare 200 pl in una siringa da 1 ml. Attaccare a 26 gauge all&#39;inizio della siringa. </li><li> Utilizzando la sinistra, nuca del mouse appena sotto le orecchie in possesso di pelle abbastanza per immobilizzare la testa e gli arti. </li><li> Inclinare il mouse modo che la sua testa è leggermente verso il suolo in modo organi interni allontanarsi dal sito di iniezione, che si trova nel quadrante inferiore destro dell&#39;addome. </li><li> Arrotolare la siringa tra i palmi delle mani e capovolgere 6 volte per distribuire uniformemente la soluzione di liposomi prima dell&#39;iniezione. </li> &lt;li&gt; Inserire l&#39;ago nella parte in basso a destra dell&#39;addome del mouse ad un angolo di 30-40 gradi. Iniettare 200 pl di soluzione di liposomi o PBS. </li><li> Nel corso di un modello sperimentale di infiammazione indotta, come la colite indotta da DSS, iniettare topi 4 giorni prima della comparsa di infiammazione sperimentale per garantire la deplezione dei macrofagi residenti e ogni 2 giorni durante il protocollo di esaurire nuovi macrofagi infiltranti. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, insieme con previste analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide per confermare esaurimento macrofagi con colorazione immunoistochimica. </li></ol> 2. Derivazione dei macrofagi polarizzati da aspirati di midollo osseo <ol><li> Il midollo osseo di topi tra gli 8 e 12 settimane di età fornisce il più alto rendimento di midollo osseo macrofagi. Euthanize il mouse, si trovava sulla sua schiena, e definire con precisione le sue zampe, che si estende gli arti, per quanto possibile. </li><li> Lavorare in uno sterile hood, rimuovere femore e tibia, tagliando via come muscolo più possibile. </li><li> Midollo filo da ossa utilizzando IMDM con 10% FCS caricato in una siringa da 5 ml dotato di un ago calibro 26. </li><li> Diluire midollo osseo aspira a 40 ml in IMDM con 10% FCS, cellule posto in un centimetro 75 2 pallone di coltura tissutale, e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 4 ore. Questo passaggio rimuove aderenti cellule mesenchimali o macrofagi maturi da progenitori ematopoietici. </li><li> Trasferire il surnatante di coltura contenente non aderenti progenitori ad un tubo da 50 ml conica Falcon e centrifugare per 5 min a 1200 rpm. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di IMDM, 10% FCS e contare le cellule nucleate diluendo sospensione cellulare 1 a 20 in acido acetico. Questa procedura lisa tutte le cellule, comprese le cellule rosse del sangue e dei nuclei restante può essere contato su un emocitometro. </li><li> Risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 10 6 cellule / ml in mezzo completo; IMDM, 10% FCS, 150 monotioglicerolo pM (MTG), e 10 ng / ml o di MCSF, GM-CSF o IL-3. MCSF derivati ​​da macrofagi attivati ​​sono classicamente macrofagi, mentre i macrofagi GM-CSF o IL-3-derivati ​​sono attivati ​​alternativamente. </li><li> Sostituire media al giorno 4, riducendo la velocità cellule non aderenti e restituirli al pallone, e al 7 ° giorno, scartando cellule non aderenti. </li><li> Inoltre, IFNy (10 ng / ml) o IL-4 (10 ng / ml) può essere aggiunto a fiasche contenenti MCSF cellule derivate al giorno 7 di macrofagi un&#39;inclinazione a un classico attivato o un fenotipo alternativa attivato, rispettivamente. Incubare le cellule per altri 3 giorni. </li><li> Al giorno 10, rimuovere i supporti e sollevare le cellule fuori del pallone di coltura tissutale con dissociazione cellulare Buffer (Gibco-BRL). Porre 5 ml di tampone sulle cellule per 5 min a temperatura ambiente (18 ° C) e poi battere il lato del pallone con il tallone del palmo della mano più volte fino. Assicurarsi che le cellule hanno sollevato del pallone esaminando il pallone sottomicroscopio. Pipettare risospese le cellule in una provetta da 15 ml Falcon e lavare il pallone con un ulteriore 10 ml di IMDM, 10% FBS. Pool e far girare le cellule per 5 min a 300 × g. </li><li> Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e risospendere ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml in PBS sterile pH 7,4. I macrofagi sono pronti per l&#39;iniezione in topi. </li><li> Riserva 1.0 × 10 6 macrofagi per la valutazione del fenotipo dei macrofagi. Classicamente macrofagi attivati ​​stimolati con lipopolisaccaridi secernono livelli elevati di ossido nitrico e dei livelli di IL-12p70 e bassi livelli di IL-10 rispetto ai macrofagi attivati ​​alternativamente. In alternativa macrofagi attivati ​​esprimono costitutivamente YM1 e arginasi I (Argi), che può essere rilevato da Western immunoblotting. </li></ol> 3. Tranferring macrofagi in topi <ol><li> Macrofagi Risospendere in PBS sterile a una concentrazione di 10 7 cellule / ml. Ciò permette una intravenous iniezione di 10 6 macrofagi in un volume totale di 100 pl, che è un volume che può essere sicurezza e comodità iniettate in topi dalla vena caudale. </li><li> Topi calda usando una piastra elettrica o di calore giro per 5-10 min per dilatare la vena della coda. Monitorare il mouse in qualsiasi momento per i segni di ipertermia. </li><li> Trasferire il mouse per un apparecchio di contenzione che permette l&#39;accesso alle vene della coda. </li><li> Ruotare la coda di 90 ° in modo che la vena è rivolta verso l&#39;alto. Vene eseguire lateralmente su entrambi i lati della coda e sia vena può essere utilizzato. </li><li> Pulire il sito di iniezione con un tampone imbevuto di alcol e lentamente iniettare 100 microlitri (10 6 macrofagi) con una siringa da 1 ml con un ago calibro 26 o 28. Inserire l&#39;ago con il lato smusso rivolto verso l&#39;alto e con una leggera angolazione, quasi parallela alla vena. </li><li> Se l&#39;ago è inserito correttamente non resistenza dovrebbe essere sentito e la vena dovrebbe essere chiaro dopo l&#39;iniezione. Se l&#39;ago non è nellavena, la coda si rigonfiamento. In questo caso, rimuovere l&#39;ago e riprovare prossimale l&#39;ultimo tentativo o in altra vena. Un nuovo ago deve essere utilizzato per ogni iniezione, come la coda è dura e gli aghi diventare opachi rapidamente durante l&#39;iniezione coda vena. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, rimuovere l&#39;ago, applicare una leggera pressione sul sito dell&#39;iniezione, fino a quando il sanguinamento si arresta, e controllare il mouse di un ulteriore 5 minuti per garantire che il sanguinamento si è fermato. </li><li> Ripetere le iniezioni macrofagi ogni 4 giorni per garantire una erogazione continua di macrofagi polarizzati durante la procedura sperimentale. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, insieme con analisi sperimentali, rimuovere i tessuti dal sito di interesse e fissare con paraformaldeide o formalina per confermare la consegna efficace di macrofagi polarizzati mediante colorazione immunoistochimica. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Il numero e fenotipo di macrop residentehages in ogni dato tessuto dipende dal tessuto in esame e cambierà durante l&#39;infezione o infiammazione. Analogamente, la capacità di clodronato liposomi contenenti da esaurire macrofagi da un tessuto dipenderà dalla via di somministrazione e consegna efficace al tessuto bersaglio. Iniezione intraperitoneale di clodronato contenenti risultati liposomi in una diminuzione F4/80 + macrofagi nel colon mouse durante DSS-colite indotta evidenti dalla colorazione immunoistochimica per il marcatore macrofagi, F4/80 (Figura 1A). Colorazione istologica può anche essere usato per determinare differenze quantitative numero macrofagi e fenotipo in sezioni di tessuto. Figura 1B mostra che una media del 55% dei macrofagi è impoverito dalla clodronato liposomi contenenti rispetto al non deplezione rilevato in due punti topo quando i topi sono iniettati con PBS da solo come un controllo dell&#39;iniezione. Ogni valore è determinato dal conteggio F4/80 e Argi macchiaEd cellule positive in sezioni di tessuto seriali topi da 6 a 3 punti, in 3 sezioni per il mouse con il conteggio viene effettuato da due individui ciechi alle condizioni sperimentali. Questi risultati dimostrano che iniezioni intraperitoneali di liposomi clodronato riducono macrofagi colon nei topi. Determinazione dei macrofagi da midollo osseo in presenza di diversi fattori di crescita rese macrofagi che sono classicamente attivati ​​(MCSF-derivato o MCSF-derivati ​​e trattati con IFNy) o in alternativa attivato (GM-CSF o IL-3-derivato o MCSF-derivati ​​e trattati con IL-4). Flushing midollo osseo da 2 femore e tibia 2 da un mouse 8 settimane vecchia produce tipicamente 6 × 10 7 cellule nucleate per il mouse e le rese 8 × 10 6 MCSF derivate dai macrofagi, 10 × 10 6 GM-CSF-derivate dai macrofagi, o 12 × 10 6 IL-3-macrofagi derivati. Figura 2A mostra nitrito e il rapporto IL-12p70/IL-10 in macrofagi supernatants trattati con lipopolisaccaride per 24 ore 2B La figura mostra una tipica analisi Western blot di 0,5 × 10 6 macrofagi da MCSF + / -. IL-4 condizioni di derivazione sondato con gli anticorpi per marcatori macrofagi attivati, in alternativa, Argi, i YM1, o con GAPDH come carico di controllo. Questi dati dimostrano che dal midollo osseo macrofagi può essere inclinato ad un fenotipo polarizzato durante la derivazione. Efficace trasferimento di ex vivo macrofagi derivati ​​polarizzate ad un tessuto dipende dalla via di somministrazione e l&#39;accesso al tessuto. Durante DSS-indotta colite, macrofagi iniettato per via endovenosa recarsi nel sito di infiammazione e macrofagi alternativamente attivati ​​ridurre la gravità della malattia. Figura 3A mostra il numero totale di macrofagi e il numero di macrofagi Argi + (in alternativa attivato) contate in sezioni istologiche da topi iniettati con polarizzata midollo osseo-Macrofagi derivati. L&#39;impatto di trasferimento di macrofagi polarizzati al colon durante DSS-colite indotta è mostrato per indice di attività della malattia, un punteggio additivo basato sulla perdita di peso, emorragia rettale, e consistenza delle feci diminuita (Figura 3B). Questi risultati dimostrano che ex vivo derivato, macrofagi adoptively trasferiti può traffico al colon e infiammazione indotta impatto. Macrofagi M1 non influenzare l&#39;infiammazione, mentre i macrofagi M2 ridurre in modo significativo Disease Activity Index. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Clodronato contenente liposomi in modo efficace e riducono F4/80 + F480 + + Argi cellule in due punti del mouse in vivo. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × sfondo 129Sv è stata data al 5% DSS per 7 giorni e IP iniettato con PBS (controllo) o clodronato contenenti liposomi (clodronato) 4 giorni prima del DSS trattamentoe ai giorni 0, 2, 4 e 6 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e il marcatore dei macrofagi M2, Argi. (B) La determinazione quantitativa di F4/80 Argi + + e macrofagi. Cellule colorate positivamente sono stati contati da due persone in cieco per condizione sperimentale a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / mouse e da 6 topi / gruppo. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. MCSF-macrofagi derivati ​​esprimere un fenotipo classicamente attivato e MCSF derivati ​​macrofagi trattati con IL-4 esprimere un fenotipo macrofagi attivati ​​alternativamente. (A) In accordo con un fenotipo classicamente attivato, MCSF derivati ​​macrofagi producono alti livelli di ossido nitrico in risposta al lipopolisaccaride e può essere misurata con il test Griess, che rileva il suo metabolita valle, nitrito. Essi alsO produrrà un rapporto IL-12p70/IL-10, che può essere misurata mediante ELISA. * P &lt;0,01 per n = 3. (B) In accordo con un fenotipo alternativamente attivato, MCSF derivati ​​macrofagi trattati con IL-4 esprimono costitutivamente YM1 e Argi, che può essere rilevato dal immunoblotting occidentale. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con risultati simili. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Iniettato per via endovenosa, ex-vivo derivato in alternativa il traffico macrofagi attivati ​​al colon e ridurre l&#39;infiammazione intestinale. Una generazione F2 di topi wild type su un C57BL misto / 6 × 129Sv sfondo sono stati dati 5% nel DSS l&#39;acqua da bere per sei giorni. Macrofagi M1 e M2 sono state iniettate ev ai giorni 0 e 4 durante il trattamento DSS. (A) I due punti sono stati rimossi, fissi, e le sezioni sono state colorate da immunoistochimica per macrofagi maturi F4/80) e un indicatore dei macrofagi M2 (Argi).La quantificazione dei macrofagi per il controllo PBS topi iniettati (C), topi iniettati con macrofagi M1 (+ M1) e topi iniettati con macrofagi M2 + M2) sono stati eseguiti da conteggio delle cellule colorate positivamente a 40 × ingrandimento in 6 campi da 3 sezioni / del mouse e da 6 topi / gruppo. Il conteggio è stato eseguito da due individui ciechi alla condizione sperimentale. (B) L&#39;attività della malattia è stata monitorata e ha segnato tutti i giorni durante il trattamento ed è un punteggio additivo a base di perdita di peso, sanguinamento rettale, e la consistenza delle feci è diminuito. * P &lt;0,05 per n = 6 topi in 2 esperimenti indipendenti.

<ol>
	<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li><li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+dendritic+cells,+macrophages,+and+epithelial+cells+in+the+gut:+implications+for+immune+tolerance.">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li><li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases.">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).</li><li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome.">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li><li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis.">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li><li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes:+perspectives+in+research+and+therapeutics.">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li><li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice.">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP-deficient,+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis.">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li><li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes.">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li><li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+mechanism+of+action,+preparation+of+liposomes+and+applications.">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li><li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism.">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li><li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues.">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li><li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization.">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation.">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li><li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation.">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I macrofagi sono cellule fagocitiche che svolgono un ruolo importante nel sistema immunitario. Essi sono responsabili per l&#39;avvio della risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Tipicamente, macrofagi attivati ​​classicamente vengono attivati ​​da IFNy o LPS e sono responsabili per eliminare patogeni e montare una risposta infiammatoria 1. Viceversa, in alternativa macrofagi attivati ​​sono attivati ​​da IL-4 o IL-13 e gioca un ruolo in detriti di lavaggio e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Clodronato liposomi contenenti </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS liposomi contenenti </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> Sterile PBS pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> acido acetico </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monotioglicerolo (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant murino MCSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino GM-CSF </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino IL-3 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino IFNy </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Ricombinante murino IL-4 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Dissociazione cellulare Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Ratto anti-F4/80 Anticorpo </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Topo anti-Argi Anticorpo </td><td> BD Transduction Laboratories </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti specifici utilizzati in questo protocollo.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

I macrofagi hanno un ruolo critico nella risposta immunitaria innata alla sfida infettiva o lesioni, iniziando la risposta immunitaria innata e dirigere la risposta immunitaria acquisita. Macrofagi disfunzione può comportare l&#39;impossibilità di montare una risposta immunitaria appropriata e, come tale, è stata implicata in molti processi patologici, quali le malattie infiammatorie intestinali. I macrofagi visualizzare fenotipi polarizzati che sono approssimativamente suddivise in due categorie. Classicamente macrofagi attivati, attivato dalla stimolazione con LPS o IFNy, svolgono un ruolo essenziale nella risposta alla sfida batterica che macrofagi attivati ​​alternativamente, attivato da IL-4 o IL-13, partecipare detriti scavenging e rimodellamento tissutale e sono stati implicati nella risoluzione fase di infiammazione. Durante una risposta infiammatoria in vivo, i macrofagi si trovano in mezzo a una miscela complessa di infiltrare cellule del sistema immunitario e possono partecipare mediante l&#39;esasperazione o resolving infiammazione. Per definire il ruolo di macrofagi in situ in un modello animale intero, è necessario esaminare l&#39;effetto di esaurire macrofagi dall&#39;ambiente complesso. Per porre domande circa il ruolo del fenotipo dei macrofagi in situ, fenotipicamente definite macrofagi polarizzati, può essere derivata ex vivo, da aspirati di midollo osseo e aggiunto nuovamente ai topi, con o senza previa deplezione dei macrofagi. Nel protocollo qui presentata clodronato liposomi contenenti, rispetto ai controlli iniettati PBS, sono stati utilizzati per esaurire macrofagi colon durante destrano solfato sodico (DSS)-colite indotta nei topi. Inoltre, macrofagi polarizzati sono stati ottenuti ex vivo e trasferito topi mediante iniezione endovenosa. Un avvertimento di questo approccio è che clodronato contenenti liposomi esaurire tutte le fagociti professionali, comprese sia le cellule dendritiche ei macrofagi in modo da garantire l&#39;effetto osservato da deplezione dei macrofagi è specifico, la ricostituzione of fenotipo mediante trasferimento adottivo di macrofagi è necessario. Deplezione macrofagi nei topi possono anche essere ottenuto topi reincrocio su un CD11b-DTR fondo, che è un ottimo approccio complementare. Il vantaggio di clodronato contenente mediata da liposomi esaurimento è che non richiede il tempo ei costi legati in topi reincrocio e può essere utilizzato in topi indipendentemente dal fondo dei topi C57BL / 6, BALB / c, o sfondo mista ).

Watch this Scientific Journal Video about Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice at JoVE.com

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i macrofagi<em&gt; In vivo</em&gt;, Derivanti da macrofagi polarizzati aspirati di midollo osseo, e trasferendo adoptively macrofagi in topi. Queste tecniche consentono la determinazione del ruolo che i macrofagi polarizzati svolgono nella salute e nella malattia.

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K Views.  University of British Columbia. I macrofagi hanno un ruolo centrale nella omeostasi e patologia in molti tessuti. Il protocollo presentato qui descrive i metodi per esaurire i macrofagi In vivo, Derivanti da macrofagi polarizzati aspirati di midollo osseo, e trasferendo adoptively macrofagi in topi. Queste tecniche consentono la determinazione del ruolo che i macrofagi polarizzati svolgono nella salute e nella malattia.

Video: Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

L&#39;esaurimento delle popolazioni di cellule specifiche da deplezione del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Ottimizzazione della degradazione per ottenere un esaurimento specifico ed efficiente delle proteine

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...