Questo protocollo aiuta a coltivare macrofagi derivati dal midollo osseo da topi carenti di iNOS o BH4 utilizzando mezzi e siero accuratamente definiti con bassi livelli di BH4 e nitrato per evitare interferenze con i meccanismi redox. Controllando attentamente i livelli di potenziali contaminanti nel processo di coltura, possiamo limitare l'interferenza dell'ossido nitrico, garantendo l'accuratezza e la riproducibilità del sistema modello. Questo metodo consente misurazioni accurate di biopterine, ossido nitrico e qualsiasi fattore a valle correlato a questi composti essenziali.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Thomas Nichol, un ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio. Per iniziare, posizionare le gambe in etanolo al 70% per due minuti per lavare via qualsiasi pelliccia o residuo. Quindi, trasferire le gambe in una capsula di Petri batteriologica pulita e sterile.
Raschiare con cura lungo la lunghezza delle ossa con la lama, tagliando i tendini e rimuovendo il muscolo dall'osso. Una volta che le ossa sono state ripulite dal muscolo, tagliare l'epifisi nella parte superiore della tibia, appena sotto il ginocchio. La tibia può essere tagliata all'estremità inferiore, appena sopra l'intersezione con il perone.
Infine, tagliare l'epifisi alle due estremità del femore, appena sotto le articolazioni del ginocchio e dell'anca. Per lavare il midollo osseo, riempire una siringa da 10 millilitri con 10 millilitri di PBS e attaccarla a un ago. Quindi inserire l'ago nella cavità midollare dell'osso.
Lavare delicatamente con uno o due millilitri di PBS, facendo scorrere l'ago su e giù. Quindi, estrarre la sospensione da cinque a dieci volte dentro e fuori da una siringa da un millilitro per disaggregare. Raccogliere la sospensione in una siringa da un millilitro e passarla attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo di centrifuga pulito da 50 millilitri.
Infine, posizionare i campioni sul ghiaccio. Per congelare il midollo osseo per un uso successivo, centrifugare le cellule a 1000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet rosso in due millilitri di antigelo.
Quindi, incubarlo a 80 gradi Celsius durante la notte. Se congelato, scongelare rapidamente la sospensione a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile pulito contenente tre millilitri di supporti DMEM/F-12.
Successivamente, pellet le celle per centrifugazione. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in tre millilitri del supporto DMEM/F-12 preparato. Contare le cellule e placcarle in oggetti di plastica non rivestiti di TC nel supporto DMEM / F-12 preparato.
Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il quinto giorno, alimenta le cellule aggiungendo il 50% del volume originale di supporti DMEM/F-12. Il sesto giorno, stimolare le cellule aggiungendo GM-CSF preparato a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per microlitro direttamente sul terreno di coltura cellulare.
Il settimo giorno, rimuovi tutti i supporti dalle celle. Quindi, lavare brevemente le cellule con PBS preriscaldato e aggiungere mezzi DMEM / F-12 contenenti il 2% di endotossina FBS bassa, 1X penicillina o streptomicina, L-glutammina, 25 nanogrammi per microlitro M-CSF e 50 nanogrammi per microlitro GM-CSF. Infine, incubare le cellule durante la notte nei mezzi per attivare i macrofagi al fenotipo M0.
Per il fenotipo M1, stimolare le cellule con 100 nanogrammi per microlitro LPS e 10 nanogrammi per microlitro IFN-gamma. Per il fenotipo M2, stimolare le cellule con 100 nanogrammi per microlitro IL-4. Incubare le cellule durante la notte.
L'ottavo giorno, le cellule sono pronte per la raccolta o la lavorazione a valle in base alle esigenze del ricercatore. I media integrati con il 10% di FBS avevano nitriti e tetraidrobiopterina simili, indipendentemente da M-CSF e GM-CSF o LCM. Ma i livelli totali di biopterina erano più alti nei mezzi integrati LCM.
Tuttavia, è stata osservata una maggiore variabilità tra i diversi lotti di LCM. La PCR ha mostrato un prodotto a coppia di basi 1030 in topi wild type, mentre i topi knockout GCH hanno prodotto un prodotto a coppia di basi 1392, confermando l'escissione degli esoni critici. Il trattamento con tamoxifene ha abolito la proteina GCH nelle cellule knockout.
Le cellule knockout e di controllo producevano ancora iNOS, dopo la stimolazione LPS e IFN. I BMDM coltivati da topi knockout GCH condizionali hanno mostrato una significativa diminuzione della tetraidrobiopterina e una diminuzione dei nitriti. Le stesse cellule coltivate in terreni LCM non avevano espressione di GCH1.
Tuttavia, le cellule producono quantità significative di tetraidrobiopterina e nitriti dopo knockout. L'ottavo giorno, non ci sono state differenze significative nella morfologia tra il controllo non attivato e i BMDM knockout GCH a diverse concentrazioni di Tamoxifene. I BMDM mostrano le caratteristiche che ci si aspetta dai macrofagi non stimolati, con cellule aderenti rotonde e estremità allungate.
Quando si lavora con cellule primarie come questa, è imperativo sterilizzare a fondo tutti i tessuti e le attrezzature. Inoltre, la scelta del giusto mezzo e integratore è importante per mantenere un ambiente basso di ossido nitrico e BH4. I pellet e i mezzi cellulari possono essere utilizzati per varie applicazioni a valle, con particolare attenzione al ruolo dell'ossido nitrico, della biopterina o dello stato redox cellulare.
Può includere HPLC, qPCR e Western blot, tra gli altri.
