I patogeni batterici utilizzano fattori di virulenza per colonizzare diverse nicchie all'interno dell'organismo ospite. Stiamo lavorando per capire come i patogeni batterici percepiscono specifici segnali ambientali nei tessuti dell'ospite per regolare l'espressione del fattore di virulenza. Il patogeno umano Yersinia pseudotuberculosis utilizza il fattore di virulenza del sistema di secrezione di tipo tre per iniettare proteine effettrici nelle cellule ospiti.
Il sistema di secrezione di tipo tre consente ai batteri di sovvertire i meccanismi di difesa dell'ospite e colonizzare i tessuti dell'ospite. Tuttavia, l'espressione del sistema di secrezione di Yersinia di tipo III è metabolicamente gravosa, quindi l'espressione dei geni del sistema di secrezione di tipo tre è strettamente regolata in risposta a stimoli ambientali come la temperatura. Le nostre precedenti pubblicazioni hanno dimostrato che l'espressione del sistema di secrezione di Yersinia di tipo III è controllata dalla disponibilità di ferro e dalla tensione di ossigeno attraverso un fattore di trascrizione chiamato ISCR.
Questi risultati sono significativi perché Yersinia colonizza i tessuti dell'ospite che variano nel loro contenuto di ferro e nella tensione dell'ossigeno. Ad esempio, il lume intestinale contiene ferro sufficiente per la crescita di Yersinia ma ha una bassa tensione di ossigeno. Al contrario, tessuti come il sangue hanno una disponibilità di ferro molto bassa ma una maggiore tensione di ossigeno.
Il nostro metodo ci permette di coltivare Yersinia in condizioni di coltura che variano nella quantità di ferro e ossigeno disponibili, per studiare come questi segnali ambientali influenzano l'espressione del sistema di secrezione di tipo tre. Questo metodo ci aiuterà a determinare il meccanismo molecolare attraverso il quale la disponibilità di ferro e ossigeno controllano l'espressione del sistema di secrezione di tipo tre e ci aiuterà a capire come questo controlli l'esito dell'infezione da Yersinia. Per iniziare, strisciare Yersinia Pseudo tuberculosis su piastre di agar da brodo di lisogine.
Incubare le piastre a temperatura ambiente per 48 ore. Una volta formate le colonie visibili, inoculare una singola colonia isolata in quattro millilitri di terreno M9. Coltivarlo durante la notte a 26 gradi Celsius con aerazione a 250 giri/min.
Posizionare una cuvetta contenente la coltura in uno spettrometro, quindi diluire la coltura in 14 millilitri di terreno M9 chelato sterile senza integrazione di ferro per ottenere un valore OD600 di 0,1. Mettere i palloni in un agitatore a 26 gradi Celsius e incubare per otto ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare la coltura per avviare tre nuove colture; due per la crescita anaerobica e uno per la crescita aerobica.
Per la coltura aerobica, diluire la coltura a un valore OD600 di 0,1 in 14 millilitri di terreno sterile chelato M9 senza integrazione di ferro. Quindi, coltura con aerazione a 26 gradi Celsius per 12 ore. Per la coltura anaerobica, diluire la coltura in 14 millilitri di terreno sterile chelato M9 in due provette di vetro lavate con acido.
Nel primo tubo, aggiungere solfato di ferro sterilizzato con filtro a una concentrazione finale di un milligrammo per litro. Nel secondo tubo, aggiungere solfato di ferro per una concentrazione finale di 0,01 milligrammi per litro. Incubare entrambe le provette in una camera anaerobica a temperatura ambiente per 12 ore.
Quindi, indurre l'attività del sistema di secrezione di tipo tre spostando le colture anaerobiche a 37 gradi Celsius e continuando l'incubazione per quattro ore. Quindi, diluire le colture in crescita aerobica a un valore OD600 di 0,2 aggiungendo 14 millilitri di terreno M9 chelato in due palloni lavati con acido. Aggiungere solfato di ferro alle concentrazioni finali richieste nei palloni .
Incubare entrambi i palloni con aerazione a 26 gradi Celsius a 250 giri/min per due ore. Dopo due ore, spostare le colture a 37 gradi Celsius con aerazione a 250 giri/min per quattro ore per indurre l'attività del sistema di secrezione di tipo tre. Dopo aver indotto il sistema di secrezione di tipo tre in Yersinia pseudotuberculosis, trasferire i volumi normalizzati di questa coltura incubati in provette da 15 millilitri.
Aggiungere quattro microlitri di albumina sierica bovina a ciascuna provetta come controllo della precipitazione proteica. Centrifugare le colture a 3, 200 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Filtrare il surnatante in una provetta fresca da 15 millilitri utilizzando un filtro PVDF da 0,22 micron collegato a una siringa.
Quindi, aggiungere acido tricloroacetico equivalente al 10% del volume del surnatante. Agitare energicamente i tubi per un minuto. Incubare le provette con ghiaccio in una stanza fredda a quattro gradi Celsius per una notte.
Quindi, aggiungere due millilitri di ciascun campione in una provetta da due millilitri, quindi centrifugare a 21.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante utilizzando un accessorio per il vuoto. Ripetere il pipettaggio di due millilitri di campione nella stessa provetta, centrifugare e aspirare il surnatante.
Consolidare le reazioni di precipitazione in un unico tubo da due millilitri. Lavare i pellet con un millilitro di acetone ghiacciato al 100% seguito da centrifugazione e aspirazione del surnatante. Dopo aver rimosso il surnatante per l'ultima volta, asciugare il pellet sul banco per un'ora.
La proteina precipitata dovrebbe apparire come una foschia lungo il lato del tubo. Quindi, risospendere ogni pellet in 50 microlitri di soluzione F-S-B-DTT. Agitare accuratamente per un minuto.
Quindi, far bollire i campioni su un blocco termico a 95 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, centrifugare brevemente alla massima velocità a temperatura ambiente. Caricare 15 microlitri di ciascun campione anaerobico e 10 microlitri di ciascun campione aerobico su un gel SDS-PAGE al 12,5% per l'analisi.
Al termine della corsa del gel, utilizzare la colorazione con argento per visualizzare le proteine sul gel. Per iniziare, posizionare un gel SDS-PAGE contenente campioni aerobici separati di Yersinia pseudotuberculosis in un sistema di imaging. Nel software, selezionare le bande che rappresentano la proteina effettrice del sistema di secrezione di tipo tre, YopE, in tutti i pozzetti.
Impostare la banda YopE di riferimento sul campione appropriato. Esporta i valori di quantificazione relativa calcolati dal software per tutte le bande YopE. Quindi, selezionare tutte le bande BSA in tutti i pozzetti.
Assicurarsi che la banda BSA di riferimento corrisponda al campione della banda YopE di riferimento. Esporta i valori di quantificazione relativi per tutte le bande BSA. Dividi il valore YopE per il valore BSA per ogni condizione per produrre risultati normalizzati.
Il gel SDS-PAGE colorato con argento ha rivelato che nei campioni anaerobici, era presente 38 volte più YopE nei campioni a basso contenuto di ferro rispetto ai campioni ad alto contenuto di ferro. Nei campioni aerobici, queste proteine sono state secrete in quantità quasi simili.
